蒙藥材山苦荬的成分鑒別及7種成分含量測定方法建立Δ

孫麗君 ，李 君 ，王秋桐 ，夏慧敏 ，王躍武 ，張 謙 ，張慧文 ，王煥蕓 #（.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 000；2.內蒙古自治區新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 000；.內蒙古醫科大學附屬醫院藥物臨床試驗機構，呼和浩特 000）

山苦荬為菊科苦荬菜屬多年生植物山苦荬Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai的干燥全草，蒙醫稱之為“蘇素-烏布斯”，現收錄于《內蒙古蒙藥材標準》。該藥性寒、味苦，具有清血熱、抗炎、抗氧化、保肝等功效，常用于蒙醫臨床肝炎、肝膽熱等疾病的治療[1]。研究表明，山苦荬中所含綠原酸、槲皮素具有協同抗炎作用[2]；原兒茶酸可通過調控Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核因子κB信號通路而達到改善肝臟炎癥的目的[3]；在四氯化碳誘導的肝損傷小鼠模型中，木犀草素可顯著降低其血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶的活性，并改善肝組織病理損傷，作用機制可能與激活核轉錄因子紅系2 相關因子2 通路有關[4]；異綠原酸A、蘆丁可通過增強抗氧化酶活性而抑制氧化應激反應，從而發揮保肝作用[5-6]。同時，課題組前期在山苦荬保肝活性部位篩選過程中發現，木犀草苷具有顯著的保肝活性[1]。

藥材所含成分含量的高低與其療效密切相關，雖有學者采用高效液相色譜法和一測多評法對山苦荬藥材進行了質量評價[7-8]，但受地域差異等因素影響，僅以單一或3種成分作為質量評價指標難以準確反映藥材整體質量，加之目前關于山苦荬的物質基礎研究有限，因此明確山苦荬的物質組成并進行質量控制對保障其臨床應用的安全性和有效性具有良好的現實意義。基于此，本研究擬運用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜技術對山苦荬藥材的物質組成進行快速、全面的鑒別分析，并采用高效液相色譜串聯三重四極桿質譜（high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術對其所含綠原酸、木犀草素、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、異綠原酸A、木犀草苷7種成分進行含量測定，旨在為該藥材質量評價體系的建立、藥效物質的挖掘提供數據支撐。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有HPLC-Q-Exactive型高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，LC-MS8045型高效液相色譜-三重四極桿液質聯用儀、AP135W型十萬分之一電子天平（日本Shimadzu公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

異綠原酸A對照品（批號PS001052，純度≥98.0%）、隱綠原酸對照品（批號PS011467，純度≥98.0%）、木犀草苷對照品（批號PS013155，純度≥98.0%）、木犀草素對照品（批號PS010346，純度≥98.0%）均購自成都普思生物科技有限公司；綠原酸對照品（批號110753-202119，純度≥98.5%）、槲皮素對照品（批號100081-202010，純度≥99.0%）、原兒茶酸對照品（批號110809-202207，純度≥98.0%）、枸櫞酸對照品（批號100396-202104，純度≥99.7%）、阿魏酸對照品（批號110773-201915，純度≥99.0%）、蘆丁對照品（批號100080-202012，純度≥98.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸均為分析純，水為蒸餾水。

山苦荬藥材（批號分別為C20210514、T20210607、H20210523）分別產自內蒙古赤峰市、通遼市、呼和浩特市，經內蒙古醫科大學藥學院中藥資源教研室渠弼教授鑒定為菊科苦荬菜屬植物山苦荬I.chinensis（Thunb.）Nakai的干燥全草。

2 方法與結果

2.1 山苦荬的成分鑒別

2.1.1 溶液的制備

（1）混合對照品溶液：精密稱定綠原酸對照品5.03 mg、枸櫞酸對照品4.12 mg、隱綠原酸對照品4.95 mg、阿魏酸對照品3.97 mg、木犀草素對照品4.20 mg、槲皮素對照品5.05 mg、蘆丁對照品4.01 mg、原兒茶酸對照品5.02 mg、異綠原酸A 對照品7.50 mg、木犀草苷對照品3.92 mg 分別置于10 mL 容量瓶中，甲醇溶解、超聲、定容，得單一對照品貯備液，質量濃度分別為503.00、412.00、495 .00、397.00、420.00、505.00、401.00、502.00、750.00、392.00 μg/mL；分別精密量取上述各單一貯備液100 μL于同一10 mL容量瓶中，得質量濃度分別為5.03、4.12、4.95、3.97、4.20、5.05、4.01、5.02、7.50、3.92 μg/mL的混合對照品溶液，于4 ℃下保存，備用。

（2）供試品溶液：取山苦荬藥材（批號C20210514）粉末（過三號篩）約1.0 g，精密稱定，放至50 mL錐形瓶中，加甲醇10 mL，稱重，封口，超聲（功率200 W，頻率50 kHz）提取30 min，冷卻至室溫，再次稱重，用甲醇補足失重，搖勻，經0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.1.2 色譜與質譜條件

（1）色譜條件：以Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×150 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～13 min，10%A→28%A；13～15 min，28%A→45%A；15～21 min，45%A→65%A；21～24 min，65%A→80%A；24～34 min，80%A→95%A；34～40 min，95%A），流速為0.4 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為5 μL。

（2）質譜條件：采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）進行正、負離子掃描；噴霧電壓為3.80 kV（正離子）/3.20 kV（負離子）；離子傳輸管溫度為300 ℃（正離子）/400 ℃（負離子）；輔助氣體積流量為30 L/min；輔助氣溫度為350 ℃；碰撞能量設置為30 eV；檢測方式為Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500；掃描范圍為m/z110～1 200。

2.1.3 數據庫建立與分析

采用中醫藥系統藥理學數據庫與分析平臺（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、中國知網、萬方數據對山苦荬藥材所含成分的名稱、分子式、多級質譜碎片進行收集整理，建立本地數據庫，利用Thermo Scientific Xcalibur 3.0軟件，對山苦荬供試品溶液和混合對照品溶液在正、負離子模式下的總離子流數據進行處理，并與本地自建數據庫比對，以一級質譜誤差＜10 ppm為標準對山苦荬中的成分進行指認[9]，并將各成分元素組成、多級質譜碎片信息及與現有對照品比對作進一步確認，最終鑒定山苦荬中化學成分。

2.1.4 山苦荬藥材化學成分鑒定

取“2.1.1”項下溶液，按“2.1.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，得山苦荬供試品溶液和混合對照品溶液正、負離子模式下的總離子流圖（圖1、圖2）。結果顯示，從山苦荬中共鑒定出45 個化學成分，包括20 個有機酸類成分、13 個黃酮類成分、4 個氨基酸類成分、4 個脂肪酸類成分、3 個核苷類成分、1 個香豆素類成分，其中10 個成分經與對照品比對得到進一步確證（表1）。

表1 山苦荬中化學成分的分析結果

圖1 供試品溶液總離子流圖

圖2 混合對照品溶液總離子流圖

以有機酸類為例，山苦荬中20個有機酸類化合物被鑒定。該類化合物是由咖啡酸與奎寧酸通過酯化縮合產生，酯鍵斷裂可產生奎寧酸特征碎片m/z191 和咖啡酸特征碎片m/z179；咖啡酸脫羧后產生特征碎片m/z135，依此可作為判斷此類化合物的裂解規律[15]。以異綠原酸A（化合物30）為例，其在負離子模式下的準分子離子峰為m/z515.119 51[M-H]-，Thermo Scientific Xcalibur 3.0軟件擬合其分子式為C25H24O12，誤差為2.150 ppm；主要碎片離子峰為m/z353.088 23、191.055 48、179.034 16、135.044 01，即準分子離子峰經高能撞擊后，首先失去1分子咖啡酸基團產生m/z353.088 23[M-H-C9H6O3]-，進一步丟失1 分子咖啡酸基團產生m/z191.055 48[M-H-C9H6O3-C9H6O3]-，或丟失1分子奎寧酸基團產生m/z179.034 16[M-H-C9H6O3-C7H10O5]-碎片離子峰，后者進一步脫去1分子CO2產生m/z135.044 01[MH-C9H6O3-C7H10O5-CO2]-。通過分子式、化合物裂解規律、相關文獻[14]及與對照品比對，確認30 號化合物為異綠原酸A。化合物30 可能的裂解途徑及二級質譜圖見圖3。

圖3 化合物30可能的裂解途徑及MS2圖

2.2 山苦荬中7種成分的含量測定

2.2.1 溶液的制備

（1）混合對照品溶液的制備：精密稱定綠原酸對照品12.58 mg、異綠原酸A 對照品5.25 mg、木犀草苷對照品9.80 mg 對照品置于同一10 mL 容量瓶中，精密量取“2.1.1”項下單一對照品貯備液木犀草素1 000 μL、槲皮素10 μL、蘆丁200 μL、原兒茶酸100 μL 置于上述同一10 mL容量瓶中，甲醇溶解、定容，得綠原酸、木犀草素、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、異綠原酸A、木犀草苷質量濃度分別為1 258.00、42.00、0.51、8.02、5.02、525.00、980.00 μg/mL 的混合對照品溶液，于4 ℃保存，加樣回收率試驗備用。

（2）供試品溶液的制備：按“2.1.1（2）”項下方法制備，搖勻，取1 mL溶液，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，經0.22 μm濾膜過濾，即得。

（3）空白對照溶液的制備：取甲醇適量，按“2.1.1（2）”項下供試品溶液制備方法處理，即得。

2.2.2 色譜與質譜條件

（1）色譜條件：以Shim-pack GIST-HP C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0.01～0.3 min，10%A→23%A；0.3～3.0 min，23%A→45%A；3.0～4.3 min，45%A→65%A；4.3～5.5 min，65%A→95%A；5.5～7.0 min，95%A；7.0～7.01 min，95%A→10%A；7.01～9.5 min，10%A）；流速為0.25 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為3 μL。

（2）質譜條件：采用ESI，以多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行負離子掃描；脫溶劑溫度為526 ℃；霧化氣流量為3 L/min；加熱氣流量為10 L/min。7個待測成分的質譜參數見表2，混合對照品溶液、供試品溶液圖譜見圖4（空白對照溶液圖譜略）。

表2 7種成分的保留時間及質譜分析參數

圖4 7種成分的MRM色譜圖

2.2.3 線性關系考察

精密量取“2.1.1（1）”項下綠原酸、木犀草素、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、異綠原酸A、木犀草苷單一對照品貯備液適量于同一10 mL容量瓶中，甲醇稀釋、定容，得質量濃度為50.300、4.200、0.505、2.005、2.510、75.000、19.600 μg/mL的混合對照品溶液，分別精密吸取上述混合對照品溶液10、20、50、100、200、400、500 μL，用甲醇分別定容至1 mL，制備系列質量濃度混合對照品溶液，按“2.2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，分別以各成分質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，通過HPLC-MS/MS聯用系統中LabSolutions軟件對各待測成分進行線性擬合，結果見表3。

表3 山苦荬中7種成分的回歸方程與線性范圍

2.2.4 精密度試驗

取“2.2.3”項下混合對照品溶液（綠原酸、木犀草素、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、異綠原酸A、木犀草苷質量濃度分別為2 515.00、210.00、25.25、100.25、125.50、3 750.00、980.00 ng/mL），按“2.2.2”項下色譜與質譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果顯示，各成分峰面積RSD均小于3.00%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩定性試驗

精密稱定山苦荬藥材粉末（批號C20210514）約1.0 g，精密稱定，按“2.2.1（2）”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時按“2.2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，各成分峰面積RSD均小于3.00%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

2.2.6 重復性試驗

精密稱定山苦荬藥材粉末（批號C20210514）約1.0 g，平行6 份，按“2.2.1（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積并代入回歸方程計算樣品含量。結果顯示，綠原酸、木犀草素、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、異綠原酸A、木犀草苷平均含量分別為2 582.90、97.73、0.95、16.52、9.35、1 031.87、1 919.05 μg/g，且RSD均小于3.00%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的山苦荬藥材粉末（批號C20210514）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入“2.2.1（1）”項下混合對照品溶液適量（加入量與已知量相等），按“2.2.1（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，綠原酸、木犀草素、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、異綠原酸A、木犀草苷的平均回收率分別為101.48%、99.83%、99.35%、96.72%、105.84%、98.29%、99.58%（RSD 分別為2.24%、2.94%、3.22%、3.16%、3.07%、2.60%、2.44%，n＝6）。

2.2.8 樣品含量測定

取3 批山苦荬藥材（H20210523、T20210607、C20210514）各3 份，按“2.2.1（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程計算樣品含量，結果見表4。

表4 不同來源山苦荬中7種成分平均含量（n＝3，μg/g）

3 討論

3.1 樣品前處理條件及成分鑒別的色譜和質譜條件優化

本課題組前期對樣品處理方式（超聲處理、加熱回流處理）、處理時間（15、30、45 min）進行考察，結果顯示，超聲處理30 min 的提取效率為最優。本課題組前期對不同流動相體系進行比較發現，相比于乙腈，以甲醇作為有機相時各成分的分離度更好；同時，在水相中加入0.1%甲酸能有效提高各成分的質譜響應并改善色譜峰峰形，故最終將流動相體系確定甲醇-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫）。傳統藥材成分組成復雜多樣，且各成分在不同電離模式下離子化程度和響應強度均有所差異，為全面、精準表征山苦荬藥材所含化學成分，本研究采用正、負兩種電離模式對山苦荬藥材中的化學成分進行辨識分析。

3.2 含量測定的質譜條件優化

傳統藥材飲片中所含成分含量的高低與其藥效的強弱、質量的優劣密切相關。為保障山苦荬藥效和質量的穩定性，本研究通過HPLC-MS/MS 技術對其中的綠原酸、木犀草素、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、異綠原酸A、木犀草苷7種成分進行了含量測定。本課題組前期采用質譜全掃描方式對各待測成分的離子化模式進行了確認，結果顯示，7種成分在負離子模式下的響應均優于正離子模式；在確認各待測成分的離子化模式后，本課題組通過設置不同碰撞能量分別進行產物離子掃描，初步獲得碰撞能量、前體離子及產物離子后，采用質譜自動優化程序對碰撞能量、前體離子及產物離子進一步優化，最終獲得各待測成分的質譜分析參數。

3.3 含量測定的結果分析

3 批不同來源山苦荬藥材含量測定結果表明，批號C20210514 和批號T20210607 的山苦荬藥材中槲皮素、蘆丁及原兒茶酸含量均明顯低于批號H20210523樣品，而其他各成分含量均明顯高于批號H20210523樣品；與批號T20210607 樣品相比，批號C20210514 的山苦荬藥材中蘆丁含量較高，而綠原酸含量較低，其他成分含量則相當。由此可見，地域差異對山苦荬藥材中上述成分的含量存在一定影響，但由于本研究涉及樣本來源較為局限，后期將擴大藥材收集范圍，作進一步評價。

綜上所述，本研究所建成分鑒別和含量測定方法快速、簡便，可為山苦荬質量標準建立提供科學依據，也可為今后山苦荬血漿移行成分解析、移行-網絡分析奠定數據基礎。