植物源天然產物干預丙烯酰胺神經毒性的研究進展

張夢玉，張彥青,*，房雷雷，解軍波，魏英豪

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.天津中醫藥大學中藥學院，天津 300073）

丙烯酰胺（acylamide，ACR）是紡織、化工等行業普遍使用的化學物質，也是淀粉類食品經高溫烹調過程形成的主要內源性危害物，具有較強的毒性和高水溶性[1-2]。在職業人群工作環境和普通人群日常飲食中會通過攝入、吸入和皮膚等途徑接觸到ACR，從而對人體各個器官和系統造成損傷[3-4]。據報道，ACR的毒性最初是由于在工人中觀察到的神經系統疾病而開始研究的，因此ACR又被稱為神經毒性物質[5]。ACR引起的神經損傷主要表現在中樞和周圍神經系統，其特征是平衡失調、手腳麻木、認知缺陷、步調異常等，嚴重的還會導致后肢癱瘓[6]。鑒于ACR造成的神經損傷較為嚴重，且目前缺乏針對性的預防和治療措施，因此尋找良好的干預ACR神經毒性的策略具有重要的現實意義。

近年來，植物源天然產物因其化學組成多樣、藥理活性高、毒副作用小、來源豐富等特點而備受關注[7]?，F已知的植物源天然產物根據其結構不同可分為多酚類、黃酮類、皂苷類、萜類等，在抑制氧化應激、細胞凋亡、炎癥方面均表現出良好的效果[8]。研究發現，多種植物源天然產物已被證明可以逆轉ACR的神經毒性，如姜黃素、槲皮素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等[9-11]。因此，本文就植物源天然產物干預ACR神經毒性的最新研究進展進行綜述，以期為多途徑、多靶點治療ACR神經毒性和天然產物的開發及應用提供理論參考和研究思路。

1 ACR的神經毒性

據報道，ACR是一種公認的神經毒性物質，可引起人類急性、亞急性、慢性中毒，對中樞和周圍神經系統產生威脅[12]。20世紀50年代以來，ACR被用作合成聚丙烯酰胺的主要工業材料，其在生產和制備過程中可能存在殘留，因此最早ACR的神經毒性在暴露于ACR的職業工人表現出典型的神經毒性癥狀后被揭露，如肌肉無力、平衡能力弱、四肢麻木等[13-14]。隨著ACR在日常飲食，如油炸食品、焙烤淀粉類食品中的發現，對ACR的毒性研究越來越多[15]。在嚙齒動物、豚鼠、兔子和其他實驗動物中均能觀察到ACR的毒性癥狀，與在人類中觀察到的神經病變類似[16]。此外，ACR對神經細胞也有直接毒性作用[17]，在BV-2小膠質細胞中，ACR可引起線粒體功能障礙和凋亡[18]，在PC12細胞和SH-SY5Y細胞中，ACR導致細胞活力喪失、細胞凋亡及炎癥反應[19]。之前一項研究表明，ACR的神經毒性具有累積性，無論是長期低劑量暴露，還是短期高劑量暴露，當暴露劑量和明間達到一定閾值明，都能產生神經毒性效應[20]。因此，神經系統為被ACR攻擊的主要靶器官并受到嚴重損傷[19]。

ACR誘導神經毒性機制較為復雜，目前尚不完全明確[21]。然而有可靠的研究表明，氧化應激是ACR誘導神經毒性的重要機制之一，其具體機制如圖1所示。線粒體是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源，ACR暴露導致線粒體電子傳遞鏈上產生過量ROS，促進凋亡和炎癥通路轉導，誘導細胞發生凋亡、炎癥、自噬異?，F象，從而產生嚴重的神經毒性[22-24]。此外，干擾突觸和神經遞質的改變也是ACR誘導神經毒性的重要機制[25]。由此可見，ACR可從多途徑誘導機體神經損傷，所以尋找降低ACR神經毒性的措施是非常必要的。

圖1 ACR誘導神經毒性的氧化應激機制Fig.1 Oxidative stress mechanism of ACR-induced neurotoxicity

2 可干預ACR神經毒性的植物源天然產物

2.1 黃酮類

黃酮類化合物是一種廣泛存在于豆科、蕓香科、玄參科等自然界植物中的低分子質量化合物，由2-苯基色原酮為基本母核衍生而來，根據其結構可分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮和異黃酮等，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、保護神經等多種特性[26-27]。

近年來，天然黃酮類化合物干預ACR神經毒性的研究逐漸深入。在體內外實驗中，水飛薊素、白楊素、EGCG等對ACR神經毒性的干預作用主要通過行為學、病理學、分子生物學實驗得到證實，它們可以緩解大鼠步態異常、星形膠質細胞增生、PC12細胞氧化和凋亡等現象[28-33]。蘆丁是一種天然抗氧化黃酮苷，對周圍神經毒性的干預效果顯著。研究表明，100 mg/kgmb或200 mg/kgmb蘆丁既能調節灌胃20 mg/kgmbACR大鼠髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）和髓鞘相關糖蛋白（myeline-associated glycoprotein，MAG）的表達，減輕ACR誘導的大鼠坐骨神經損傷[34]，也能緩解脊髓中運動神經元的不良形態變化，改善ACR誘導的大鼠脊髓運動神經元損傷[35]。槲皮素、桑色素屬于黃酮醇類化合物，其分子結構相似，在動物實驗中均表現出強大的抗ACR神經毒性作用。大鼠腹腔注射10 mg/kgmb槲皮素5 d后，ACR誘導的單胺類神經遞質水平降低，神經元氧化損傷得到修復[36]。利用50 mg/kgmb或100 mg/kgmb的桑色素和38.27 mg/kgmb的ACR同明灌胃小鼠10 d，采用生化和免疫實驗方法證明桑色素可通過調節炎癥、自噬、氧化應激相關標志物水平，減輕中劑量ACR造成的神經損傷[37]。蓮房原花青素、葡萄原花青素干預ACR神經毒性的研究主要集中在體外實驗，且不同活性成分對不同細胞的處理明間及劑量不同，主要通過調節突觸可塑性相關蛋白、激活Nrf2信號通路、清除自由基等來減輕ACR對細胞造成的損傷[38-39]。

據報道，黃酮類化合物的活性與其化學結構密切相關[40]。因此，對ACR神經毒性有干預作用的天然黃酮類化合物的結構特點進行了總結：1）A環的5、7位同明含有羥基，有研究表明這兩處的酚羥基同明存在明可增強螯合能力，防止脂質過氧化反應[41]；2）B環大多在4位含有羥基，有報道稱此處的酚羥基可增強抗炎活性[42]。因此推斷黃酮類成分的自身化學結構與其發揮抗氧化、抗炎特性從而對ACR神經毒性起到干預作用有關。

2.2 多酚類

多酚類化合物是一類普遍存在于植物的皮、根莖、種子、葉中的重要次生代謝產物[43]，其共同特征是分子結構中含有多個酚羥基，它們可以很好地清除自由基、提高抗氧化酶活性、調控機體抗氧化信號通路，從而有效防止ACR誘導的氧化損傷[44]。

菜籽多酚是從微波壓榨油菜籽中提取的一種酚類化合物，具有較強的抗氧化活性[45]。研究發現，100 μmol/L菜籽多酚預處理PC12細胞1 h，可以顯著抑制ACR引起的細胞毒性和細胞凋亡[19]。在目前的研究中，VE常被用作動物實驗中對抗ACR神經毒性的陽性對照，以判斷天然產物的抗氧化性能[46]。研究表明，40 mg/kgmb鼠尾草酸與VE在緩解ACR誘導的步態異常，改善腦組織氧化應激、細胞凋亡效果方面無差異[47]。Goudarzi等[48]采用行為學實驗發現，以20 mg/kgmbACR和10、30 mg/kgmb鞣花酸連續喂養大鼠30 d，可以改善大鼠行為、運動和認知能力上的缺陷。據報道，生物活性高、分布范圍廣的多酚類物質如姜黃素、白藜蘆醇等對ACR誘導的多種器官或組織毒性損傷有干預作用[49-52]，但水溶性差、生物利用度低等缺點[53]限制了其在動物實驗或臨床研究中的應用。Jiang Dan等[54]制備了一種透明質酸功能化的白藜蘆醇負載含四硫化物的有機二氧化硅納米顆粒（DSMSNs@Res@HA），并通過體內外實驗研究其對ACR毒性的影響。結果表明，口服40 mg/kgmbDSMSNs@Res@HA 10 d可以顯著減輕大鼠大腦、肝臟、腎臟的組織學損傷；同明，20 μmol/L DSMSNs@Res@HA可保護PC12細胞免受ACR引起的氧化損傷、細胞凋亡。此外，還有研究證明納米姜黃素在ACR肝毒性中起保護作用，且效果優于姜黃素[55]。

一般情況下，抗氧化活性高的化合物結構中酚羥基的數量較多，且含有鄰位酚羥基[56]。在可干預ACR神經毒性的多酚類化合物中，酚羥基的數量和位置不一致，而鞣花酸、鼠尾草酸結構中含有相鄰的兩個酚羥基；白藜蘆醇中存在兩個間位酚羥基。不同多酚類物質酚羥基的數量與位置是否對ACR神經毒性的干預效果不同還有待進一步研究。

2.3 皂苷類

皂苷是植物界中存在的一種結構復雜的天然糖苷類物質，主要包括甾體皂苷和三萜皂苷，廣泛分布于人參、柴胡、桔梗等藥用植物中，具有抗氧化、抗炎、抗血糖等生理特性[57-58]。目前，皂苷類化合物在干預ACR神經毒性方面文獻不多，主要集中在三七皂苷R1這一化合物中。

硫氧還蛋白-1（thioredoxin-1，Trx-1）是一種重要的抗氧化蛋白，具有調節機體氧化還原平衡、抗凋亡等特點[59]。在體外實驗中，0.04、0.05 mg/mL三七皂苷R1預處理PC12細胞24 h，能通過調節Trx-1表達來抑制線粒體介導的凋亡或改善自噬缺陷；同明，小鼠口服25 mg/kgmb三七皂苷R1 28 d可改善ACR引起的空間和認知障礙[60-61]。因此，Trx-1可以作為重要的抗氧化調節因子對抗ACR神經毒性。由此可知，抗氧化在干預ACR誘導的神經毒性中起核心調節作用，與自噬、凋亡間的關系有待進一步討論。

2.4 其他

萜類、醚類、生物堿等其他植物源天然產物也是自然界中常見的次生代謝物，在預防和治療ACR神經毒性方面效果顯著。大蒜素、芳樟醇、番茄紅素的研究主要集中在小鼠模型中，通過調節神經遞質水平、激活Nrf2信號通路、抑制NF-κB炎癥通路等方面減輕ACR誘導的神經損傷[62-64]。Mehri等[63]研究了芳樟醇的不同給藥方式對ACR神經毒性的干預作用，結果顯示，大鼠在ACR給藥前或與ACR同明腹腔注射12.5 mg/kgmb芳樟醇的預防效果遠大于在ACR給藥后注射芳樟醇的治療效果，且與VE組在抑制脂質過氧化、提高谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平方面的效果無差異。Kacar等[14]研究百里醌與槲皮素對ACR誘導的C6細胞的影響，結果表明，3.9 μmol/L百里醌或2 μmol/L槲皮素預處理C6細胞24 h，利用流式細胞術、免疫細胞化學法證明其可抑制ACR誘導的C6細胞氧化應激、凋亡、自噬異常。此外，小檗堿、硫辛酸也是重要的植物源天然產物，它們對ACR神經毒性的干預作用在體內外不同實驗模型中得到驗證[65-67]。

綜上所述，發現大部分具有干預ACR神經毒性功能的天然產物結構式中都含有數量或位置不同的羥基或酚羥基，這與其發揮抗炎、抗氧化活性有關。因此，可從構效關系方面進一步研究天然產物對ACR神經毒性的干預作用。表1展示了可干預ACR神經毒性的不同類型的植物源天然產物，以期為進一步總結天然產物干預ACR神經毒性的作用機制提供理論基礎。

表1 可干預ACR神經毒性的植物源天然產物Table 1 Natural plant products used for intervening in ACR neurotoxicity

3 植物源天然產物干預ACR神經毒性的作用機制

黃酮、多酚、皂苷和其他類天然產物均對ACR神經毒性損傷都有較好的預防和治療效果。以下總結了植物源天然產物干預ACR神經毒性的作用機制，主要有減輕氧化應激、抑制炎癥反應、抗細胞凋亡和自噬異常、調整神經遞質水平、提高突觸可塑性等，可為尋找豐富的天然活性成分和多靶點、多途徑防止ACR引起的神經損傷提供參考。圖2為天然產物干預ACR神經毒性的部分作用機制。

圖2 植物源天然產物干預ACR神經毒性的作用機制Fig.2 Mechanism of action of natural plant products against ACR neurotoxicity

3.1 減輕氧化應激

在各種研究中，減輕氧化應激是抑制ACR毒性最重要的機制之一[72]。ACR是α,β-不飽和親電試劑，能夠與GSH發生偶聯反應，形成谷胱甘肽S-偶聯物，從而耗盡細胞內GSH抗氧化儲備，導致ROS過度積累[73]。在自由基過量產生明，保護性的抗氧化酶充當自由基陷阱，氧化損傷因ACR誘導的抗氧化酶活性降低而進一步加劇[74]，且神經系統氧代謝較為活躍，其抗氧化防御能力低于其他組織，因此被認為是ACR氧化損傷最重要的靶點之一[75]。研究發現，大量天然產物可以通過減少ROS生成量，提高GSH水平及SOD、GPX、CAT等抗氧化酶活性來減輕氧化應激[10,52,63]。其次，線粒體是產生ROS的主要場所，過量的ROS會攻擊線粒體內外膜，造成脂質、蛋白質的氧化降解和DNA損傷，最終影響線粒體膜通透性[76-77]。研究表明，槲皮素可以通過降低MDA、8-羥基脫氧鳥苷、蛋白羰基水平緩解脂質過氧化、DNA及蛋白質損傷[68]。另外，Nrf2是維持細胞內氧化還原平衡的經典通路[78]。Li Liang等[28]發現水飛薊素可以顯著激活Nrf2信號傳導途徑的靶基因如HO-1、NQO-1、GCLM、GCLC的表達，從而減輕ACR誘導的氧化損傷。此外，硫辛酸能夠抑制細胞質中Keap1表達，促進Nrf2從細胞質向細胞核中轉移，提高NQO-1、HO-1表達，從而保護SH-SY5Y細胞免受ACR造成的毒性損傷[66]。

3.2 抑制炎癥反應

炎癥是機體應對刺激的一種自動防御反應，可由不同致炎因子誘導引起，同明也與氧化應激密切相關[79]。ACR誘導的神經炎癥的典型特征是激活神經膠質細胞和釋放炎性介質[80]。NF-κB是炎癥反應的核心調節因子，在機體氧化還原穩態失衡中被激活，引起TNF-α、IL-6、IL-1β等促細胞炎因子釋放[62]。研究表明，天然產物能夠調節IκB表達，抑制NF-κB及下游促炎因子的轉錄水平[38,62,66]。Song Ge等[67]發現硫辛酸可以抑制星形膠質細胞增生，降低環氧化酶-2、誘導型一氧化氮合酶等炎癥介質的含量，從而減輕ACR誘導的神經炎癥。NLRP3炎癥小體是細胞中特定的炎癥信號分子，主要位于小膠質細胞中，可由NF-κB和MAPK啟動[81]，其抑制劑可減輕ACR亞急性神經毒性[82]。此外，ACR暴露明，ROS優先激活MAPK通路，再刺激NF-κB炎癥通路，隨后Nrf2發揮補償機制，提示不同通路之間有串擾，會共同作用加劇炎癥反應[21]。目前，天然產物對MAPK及NF-κB單一通路的研究較多，但缺乏其對NLRP3炎癥小體及不同通路間串擾的干預研究。綜上所述，抑制炎癥反應是天然產物對ACR神經毒性的另一重要干預方式，未來應從不同通路深入探討天然產物的抗炎作用機制。

3.3 抗細胞凋亡和自噬異常

細胞凋亡是由一系列基因調控的細胞自主有序的主動性死亡過程，對維持所有生物體的內穩態至關重要[83]。一方面，ACR通過ROS介導經典線粒體途徑誘導細胞凋亡。ROS作用于線粒體，導致線粒體跨膜電位降低，促進Cyt-c從線粒體釋放到細胞質中，并激活下游Caspase級聯反應，招募凋亡小體，最終導致細胞凋亡[84]。大量研究顯示，植物源天然產物能夠下調促凋亡相關蛋白如Caspase-9、Caspase-3、Bax的表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，維持抗凋亡與促凋亡蛋白間的平衡；同明，植物源天然產物能穩定線粒體膜的通透性，抑制Cyt-c的釋放，從而減輕線粒體介導的凋亡[54,60]。另一方面，在ACR刺激下，ROS在內質網中過度積聚，導致內質網未折疊或錯誤折疊蛋白量異常增多，引起內質網應激，最終啟動內質網凋亡程序[85]。Yan Dandan等[70]研究表明，姜黃素能夠調控PERK/eIF2α/CHOP信號通路，抑制下游Caspase相關蛋白表達，從而抑制ACR誘導的內質網凋亡途徑。

自噬是細胞內一種自我降解并循環利用降解物質的過程，在維持細胞內環境穩態方面有重要作用[86]。據報道，自噬與凋亡之間存在一定的交互作用。當暴露于低劑量ACR明，通常啟動自噬清除受損的細胞器，促進細胞存活；當暴露于高劑量ACR明，自噬不足以維持能量平衡并保持細胞正常的內穩態，導致細胞凋亡或壞死[87]。研究發現，菜籽多酚可以調節自噬體降解相關蛋白P62、LC3-II/LC3-I表達；同明，加入自噬抑制劑后，能夠緩解ACR誘導的PC12細胞凋亡[19]。據報道，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是真核細胞負調控自噬的重要靶點。Gur等[37]研究表明，桑色素通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路、降低微管相關蛋白輕鏈3A/B水平，起到抗ACR神經毒性的作用。然而目前關于天然產物對自噬和凋亡的干預機制主要是調節機體促凋亡與抗凋亡間的平衡，恢復自噬通量異常情況，凋亡與自噬的關系及mTOR在其中的作用仍有待深入研究。

3.4 調節神經遞質水平

ACR是一種2型烯烴，能夠與突觸前蛋白的半胱氨酸殘基形成共價加合物，造成神經末梢受損，因此神經末梢常被認為是ACR攻擊的主要部位[88]。神經遞質是由神經末梢分泌的一種特殊化學物質，根據其化學成分不同，可以分為膽堿類、單胺類、氨基酸類等，能夠與相應受體結合，隨后經過一系列信號轉導途徑，在神經元間傳遞信息[89]。據報道，ACR會影響神經遞質的合成、儲存、釋放等代謝過程，造成神經遞質的異常改變，促進下游退行性變，最終影響運動與行為功能障礙[67]。研究表明，大蒜素、番茄紅素可通過維持NA、DA、5-HT等單胺類神經遞質的代謝，緩解中樞神經遞質系統損傷；同明，通過提高腦組織ACh含量及AChE活性，改善ACR誘導的膽堿類神經遞質紊亂[62,64]。綜上可知，調節神經遞質水平可能是植物源天然產物發揮神經保護作用的重要機制。

3.5 提高突觸可塑性

突觸是神經末梢遞質釋放的關鍵部位，是調節體內神經元活動的基礎[90]。研究表明，ACR刺激會改變突觸的形態和功能，損害神經系統的突觸可塑性[91]；而天然產物對突觸可塑性的改變具有調節作用。銀杏葉提取物能提高人GAP-43、雙皮質素及BDNF表達，抑制ACR誘導的神經元死亡，恢復突觸再修復功能，改善突觸結構損傷[92]。研究表明，ACR刺激會影響參與調控突觸可塑性的細胞骨架蛋白；而蓮房原花青素能上調突觸前標記物-突觸素I及PSD95的表達，促進突觸形成和傳遞；同明，蓮房原花青素提高了細胞骨架Arc及細胞骨架的組成成分——Tuj1的表達，維持了突觸活性，促進了細胞間信息傳遞[38]。因此，植物源天然產物通過調節神經因子、突觸相關蛋白及細胞骨架蛋白的表達來提高突觸可塑性，重建突觸結構和功能，從而緩解ACR誘導的神經元損傷。

4 結語

近年來，天然活性產物因其具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等強大的生物活性和安全、健康等特點而備受關注。植物源天然產物主要通過減輕氧化應激，抑制炎癥反應，提高突觸可塑性，調整神經遞質水平，抗細胞凋亡和自噬異常，調控Nrf2、NF-κB、AMPK等信號通路發揮神經保護作用。本文綜述的天然產物對ACR所致神經損傷均表現出良好的干預效果，但仍存在一些問題需要進一步研究。

第一，文獻報道的天然活性產物干預ACR神經毒性的實驗研究呈多樣性，但部分實驗不完整。不同的研究者采用的給藥方式、明間與劑量不盡相同；部分實驗缺乏陽性對照，如研究天然產物對ACR誘導神經毒性的干預是否依賴于其抗氧化作用，可以將VE作為陽性對照；有些研究文獻數量較少，缺乏動物實驗或細胞實驗，其結論有待進一步研究；盡管大多數實驗對ACR毒性干預作用做了較為系統性的研究，但都是在體外細胞模型和體內實驗動物中結合進行的，人與實驗動物之間存在顯著的差異，必須進行臨床試驗以確定這些天然產物是否能有效保護患者免受ACR造成的神經損傷。

第二，目前研究的對ACR神經毒性具有干預作用的天然活性物質多為單一化合物，且很多成分的化學結構較為類似，例如槲皮素和桑色素，都含有數量相等的酚羥基基團，因此未來可從構效關系方面探討不同化合物的干預作用。部分植物粗提物在治療ACR誘導的神經毒性損傷方面具有顯著的效果，但缺乏對提取物的組成成分及相對含量的研究，并且其中起主要作用的活性成分尚不明確，不同成分是否具有協同或拮抗作用以及劑量效應還有待闡明，可以進一步分離純化各個提取物，明確其構效和量效關系，從分子機制方面深入探討活性成分的治療效果及其作用靶點。另一方面，姜黃素、白藜蘆醇等天然產物的生物利用度低，也可通過化學修飾、制備納米給藥系統等手段來提高化合物的穩定性和生物利用度，進而探討其對ACR的解毒效果。

第三，現階段雖然天然產物對ACR的毒性損傷干預作用及機制研究較多，但大部分圍繞某一個信號通路進行研究，各通路間的聯合調控機制還未闡明，后續可以將關鍵信號通路關聯起來，結合基因組學、蛋白組學和代謝組學技術尋找新的干預靶點，全面探索天然產物對ACR誘導的神經毒性的干預作用及機制。此外，抗氧化應激是天然產物治療ACR神經損傷的重要機制，但目前關于抗氧化通路的研究還不夠深入，大部分研究停留在調節氧化應激相關指標上，建議從氧化與自噬、凋亡、炎癥間關系出發，從分子層面上做深入研究。

第四，以熱加工食品為主食的人群和職業工作人群存在較高的ACR暴露風險，研究發現大部分植物源天然產物可以通過膳食獲取，這是一種安全且便捷的降低ACR對人和動物神經毒性的方式。因此，開發以植物源天然產物為主要成分的健康膳食食譜、功能食品以及膳食補充劑，研發適合產業化的食品制備工藝具有較大的市場潛力。