三產地百香果皮酚類成分及其抗氧化活性

么亞妹，景繼月，陳奕彤，韓和璧，3，田永濤，王文蜀，3*

（1.中央民族大學 質譜成像與代謝組學國家民委重點實驗室，北京 100081；2.中央民族大學 生命與環境科學學院，北京 100081；3.中央民族大學 民族地區生態環境國家民委重點實驗室，北京 100081）

氧化應激是細胞在特定的環境下產生過量自由基，造成機體氧化與還原反應動態系統失衡的現象。氧化應激最終會引起細胞不可逆損傷，導致機體免疫力下降[1]。攝入外源抗氧化劑可以有效保護機體免受氧化應激帶來的損傷，進而避免一系列慢性疾病發生，而人工合成抗氧化劑（如二丁基羥基甲苯）多具有毒副作用[2]。現代研究表明，植物提取物中的多酚[3]、黃酮[4]和生物堿[5]等化合物對維持體內氧化還原動態平衡具有重要作用。開發“綠色、無毒”的天然抗氧化物質一直是相關領域的研究熱點。

百香果（Passiflora edulis Sims）學名西番蓮，原產于巴西，1960 年引入我國臺灣進行種植，其果實口感酸甜，除含有維生素、糖等基本營養物質外[6]，還富含多酚、三萜和生物堿等次級代謝物[7]，具有抗炎、抗氧化、降血糖和神經保護等生物活性[8]。因經濟價值顯著，百香果在我國四川、廣西和福建等地作為扶貧產品廣泛種植。不同地區百香果生長環境（陽光、降雨、溫度）的差別會導致其果實內酚類代謝物產生化學變異性[9]。鄒江冰等[10]研究發現百香果葉中異葒草素和葒草素含量均存在產地差異。目前，國內外研究集中于百香果果肉、葉，而對果實占比最大的果皮研究較少，Domínguez-Rodríguez 等[11]從4 種百香果皮中分離鑒定出57 個酚類化合物，表明百香果皮是酚類化合物的優質來源。因此，研究不同產地百香果皮酚類化合物，對百香果皮相關產品深加工和精準開發具有重要指導意義。

本研究選取四川、廣西和福建三產地百香果皮為原料，分析其酚類成分及含量，采用4 種方法評價其抗氧化能力，并結合皮爾遜相關分析方法，尋找對抗氧化活性起重要作用的酚類化合物，旨在為基于百香果皮的天然抗氧化劑或功能性食品高效開發提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫皮百香果（Passiflora edulis Sims）分別采自四川省涼山彝族自治州德昌縣、廣西壯族自治區玉林市和福建省龍巖市。

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、醋酸鈉、冰醋酸、無水甲醇、無水乙醇（均為分析純）：天津致遠化學試劑有限公司；大孔吸附樹脂AB-8：天津市大茂化學試劑廠；Trolox：上海麥克林生化科技股份有限公司；福林酚、Na2CO3、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、β-胡蘿卜素、亞油酸、吐溫40、硫酸亞鐵、沒食子酸（≥98%）、葒草素（≥98%）、牡荊素（≥98%）、蘆丁（≥98%）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪[2，4，6-tri （2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]、2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲酸（均為色譜純）：美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（V-750）：日本Jasco 公司；酶標儀（EnSpire）：美國PerkinElmer 公司；液相色譜-質譜聯用儀（Agilent 1200 HPLC/Agilent 6520 Q-TOF）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 百香果皮酚類化合物提取與制備

總酚提取：百香果皮陰干粉碎，按照文獻[12]建立的百香果皮總酚提取工藝，分別稱取三產地4 g 百香果皮粉，溶于70%乙醇溶液，在料液比1∶40（g/mL）條件下超聲30 min 后，冷凝回流90 min。經抽濾、真空濃縮，吹干得粗提物浸膏。純化：用超純水溶解所得百香果皮粗提物浸膏，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，所得正丁醇部分萃取液經真空抽濾后，過AB-8 大孔樹脂層析柱，分別用水、40%乙醇溶液、70%乙醇溶液洗脫，洗脫液旋蒸、吹干，得四川（SC）、廣西（GX）、福建（FJ）三產地分析物，用作成分及抗氧化活性分析。

1.3.2 百香果皮中總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteau 法[13]測定總酚含量，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，得到沒食子酸標準曲線回歸方程：y=0.131 8x+0.047 2，R2=0.999 2，以每克百香果皮干重中所含沒食子酸當量（mg GAE/g DW）表示總酚含量。

1.3.3 百香果皮中酚類成分的液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析

樣品溶液制備：用甲醇溶解1.3.1 中純化后樣品，以3 000 r/min 離心10 min，過0.22 μm 濾膜備用。色譜條件為色譜柱：Athena C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相：A 相為乙腈，B 相為0.1%甲酸水；流速1 mL/min；進樣量3 μL；掃描范圍200～600 nm；信號通路：210、254、270 nm。洗脫程序：0～5 min，3%～10%A；5～10 min，10%～11% A；10～25 min，11% A；25～35 min，11%～14% A；35～45 min，14%～100% A。質譜條件：電噴霧電離源；離子源溫度300 ℃，正離子模式檢測；掃描范圍m/z：80～2 000 ；錐孔電壓30 V。化合物鑒定：通過比照標準品、查閱文獻和數據庫（HMDB https：//hmdb.ca/）進行鑒定。

1.3.4 百香果皮中酚類成分含量測定

用葒草素、牡荊素和蘆丁配制成濃度為62.50 μg/mL的混合標準品溶液后等梯度稀釋成6 份，按照1.3.3液相色譜與質譜條件進樣，以標準品實際濃度為橫坐標，各標準品峰面積為縱坐標，得到各標準品標準曲線和回歸方程，葒草素：y=562 410x+415 498 （R2=0.999 0），牡荊素：y=669 518x+527 751（R2=0.999 2），蘆丁：y=308 073x+40 140（R2=0.999 0），百香果皮中葒草素、牡荊素和蘆丁含量以每克百香果皮干重中所含蘆丁當量（μg RT/g DW）、葒草素當量（μg OR/g DW）和牡荊素當量（μg VI/g DW）表示。

1.3.5 百香果皮體外抗氧化能力分析

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力測定

參考Polatoglu 等[14]的方法，用甲醇配制0.1 mmol/L的DPPH 工作液及樣品和陽性對照BHT 溶液，分別吸取100 μL DPPH 工作液與100 μL 待測樣品加入96 孔板，混勻，室溫25 ℃避光反應30 min，在517 nm 處測定吸光度。以BHT 為陽性對照代替樣品按照以上步驟測定吸光度。DPPH 自由基清除率（W1，%）計算公式如下。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為樣品與DPPH溶液混合后的吸光度；A2為樣品溶液與甲醇混合后的吸光度。所得結果用DPPH 自由基半數清除濃度（SC50，μg/mL）表示。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

采用Li 等[15]的方法并作適當調整，混合0.2 mL 7.4 mmol/L ABTS 溶液與0.2 mL 2.6 mmol/L K2S2O8溶液，置于黑暗室溫條件下反應12 h 后用無水甲醇稀釋為工作液，直至其在紫外可見分光光度計下測得吸光度為0.70±0.02。96 孔板中加入180 μL 工作液與20 μL Trolox 標準液，于734 nm 處測定吸光度，得標準曲線。以Trolox 標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：y=-1.560 3x+0.699 7，R2=0.999 1，將樣品吸光度代入標準曲線回歸方程，計算其抗氧化能力，所得結果用Trolox 當量（mmol TE/g）表示。

1.3.5.3 鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）測定

參考Benzie 等[16]的方法并進行適當調整，將醋酸鈉、TPTZ 溶液（40 mmol/L）和FeCl3·6H2O（20 mmol/L）溶液按照體積比10∶1∶1 充分混合后得到FRAP 工作液，使用超純水配制100 mmol/L FeSO4·7H2O 母液。96 孔板中加入180 μL FRAP 工作液與20 μL FeSO4·7H2O 溶液充分混合均勻后，于593 nm 處測定吸光度，以Fe2+濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：y=1.639 7x+0.068 4，R2=0.999 7。將樣品吸光度代入標準曲線回歸方程，計算其FRAP 值，所得結果用Fe2+當量（mmol Fe2+/g）表示。

1.3.5.4 自由基抑制能力測定

乳狀液中的亞油酸能自動氧化生成自由基，從而與β-胡蘿卜素反應使其顏色變淺。在抗氧化劑存在時，亞油酸氧化速率減慢，自由基生成數目變少。通過β-胡蘿卜素-亞油酸法測定樣品自由基抑制能力，參照文獻[17]的方法，稍加改進，用氯仿分別配制0.01 g/mL β-胡蘿卜素、0.01 g/mL 亞油酸、0.2 g/mL 吐溫40 溶液各5 mL。吸取0.02 mL β-胡蘿卜素氯仿溶液、0.04 mL 亞油酸氯仿溶液、0.25 mL 吐溫40 氯仿溶液于三角瓶中，超純水定容至130 mL，混勻，無明顯油狀液滴，得β-胡蘿卜素-亞油酸工作液。取1 mL 工作液加入0.2 mL 不同濃度樣品的甲醇溶液，420 nm 下測吸光度A，50 ℃恒溫水浴120 min 后測吸光度A1，另取不添加β-胡蘿卜素混合溶液為空白，測其吸光度A0。自由基抑制率（W2，%） 計算公式如下，結果用自由基半抑制濃度（IC50，mg/mL）表示。

1.4 數據處理

所有試驗平行3 次，結果用平均值±標準差表示，以Origin 繪圖。質譜數據由Mass Hunter Analysis B.06.00 軟件分析，使用SPSS 19.0 進行單因素差異顯著性分析和抗氧化試驗數據處理，采用Pearson 法進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 百香果皮中總酚含量測定結果

三產地百香果皮總酚含量見圖1。

圖1 三產地百香果皮總酚含量Fig.1 Total phenolic content of P.edulis Sims peel from three producing areas

從圖1 可以看出，三產地百香果皮總酚含量豐富，四川、廣西和福建百香果皮總酚含量分別為（20.51±0.56）、（20.15±2.20）、（15.89±0.57）mg GAE/g DW。Domínguez-Rodríguez 等[11]測定哥倫比亞地區紫皮百香果（P.edulis Sims）果皮總酚含量為24.96 mg GAE/g DW，甜果西番蓮（P.ligularis Juss）果皮和厄爾多瓜地區黃金百香果（P.edulis Sims flavicarpa） 果皮中總酚含量分別為5.08、8.34 mg GAE/g DW。Samyor 等[18]報道了阿魯納恰爾邦地區紫皮百香果皮總酚含量為2.58 mg GAE/g DW。百香果產地、采收期或處理方式不同可能是其總酚含量出現差異的原因。

2.2 百香果皮中酚類成分的LC-MS 鑒定結果

三產地百香果皮總離子流圖見圖2，酚類化合物鑒定結果見表1。

表1 三產地百香果皮酚類成分鑒定結果Table 1 Identification of phenolic compounds in P.edulis Sims peel from three producing areas

圖2 三產地百香果皮質譜圖Fig.2 Mass spectrogram of P.edulis Sims peel from three producing areas

如圖2 和表1 所示，從三產地百香果皮中共鑒定出2 種酚酸和5 種黃酮類化合物。具體為四川百香果皮樣品中鑒定出7 個酚類化合物，廣西百香果皮樣品中鑒定出4 個黃酮類化合物，福建百香果皮樣品中鑒定出5 個黃酮類化合物。

保留時間為12.56 min 時，化合物1 分子離子峰[M+H]+為m/z 303.107 1，二級質譜碎片符合文獻[11]中提到的裂解規律，推測其為鞣花酸。保留時間為14.16 min時，化合物2 分子離子峰[M+H]+為m/z 271.118 4，符合文獻[19]的質譜數據，推測其為3，4'，7-三羥基黃酮。保留時間為16.75 min 時，化合物3 分子離子峰[M+H]+為m/z 387.201 3，離子碎片符合文獻[19]中的裂解規律，推斷其為芥子酸-O-己糖。保留時間為25.56 min時，化合物4 分子離子峰[M+H]+為m/z 449.108 1，離子碎片與標準品、文獻[20]的結果一致，確定其為葒草素。保留時間31.44 min 時，化合物5 的準分子離子峰[M+H]+為m/z 431.190 6，離子碎片與數據庫描述一致，因此推測其為Derhamnosylmaysin。保留時間為35.84 min時，化合物6 分子離子峰[M+H]+為m/z 433.114 9，離子碎片與標準品的裂解規律一致，鑒定其為牡荊素。保留時間為38.12 min 時，化合物7 分子離子峰[M+H]+為m/z 611.160 2，二級質譜裂解規律與標準品、文獻[21]的結果一致，因此確定其為蘆丁。

三產地百香果皮酚類化合物種類不同，該結果與Yang 等[22]發現不同產地山楂含有不同酚類化合物的研究結果一致。從四川百香果皮中檢測出的酚類化合物數量多于廣西和福建樣品，其中化合物1 和3 是四川百香果皮的特有多酚。Zhang 等[23]研究發現紫外線能夠促進植物體內酚類化合物的合成與積累，四川百香果栽培區海拔高于其他兩地，海拔越高紫外線越強，這可能是四川百香果皮酚類化合物多于廣西和福建樣品的原因。

2.3 百香果皮中酚類成分含量測定結果

三產地百香果皮共有酚類化合物（葒草素、牡荊素和蘆丁）含量測定結果見表2。

表2 三產地百香果皮3 種酚類化合物含量測定結果Table 2 Content of three phenolic compounds in P.edulis Sims peel from three producing areas

由表2 可知，四川百香果皮中葒草素、牡荊素和蘆丁含量最高，分別為（0.79±0.05）μgOR/gDW、（0.16±0.01）μg VI/g DW 和（9.01±1.05）μg RT/g DW。四川和廣西百香果皮蘆丁含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于福建百香果皮中蘆丁含量（P＜0.05），三產地蘆丁含量均高于Barbosa 等[24]研究得到的巴西產黃金百香果皮的蘆丁含量（0.04 μg RT/g FW）。四川百香果皮中葒草素含量顯著高于廣西和福建（P＜0.05），但福建和廣西百香果皮葒草素含量差異不顯著（P＞0.05），三產地葒草素含量均高于紫皮百香果葉中葒草素含量（0.13 μg OR /g DW）[25]；四川百香果皮中牡荊素含量顯著高于廣西、福建百香果皮和紫皮百香果葉中牡荊素含量（0.07 μg VI/g DW）[25]，福建和廣西百香果皮中牡荊素含量差異不顯著（P＞0.05）。酚類化合物的共軛結構可以保護植物免受紫外線的傷害，因此紫外線能夠促進酚類化合物的積累[26]。四川地區緯度高，光照時間長，且百香果栽培區海拔約1 380 m，高于廣西（100 m）、福建（652 m）百香果栽培區的海拔，長時間紫外線照射可能是四川樣品積累更高含量酚類化合物的原因，但各產地酚類化合物含量差別還需綜合考慮降雨、溫度等因素影響。

2.4 百香果皮抗氧化能力分析

三產地百香果皮抗氧化能力結果見圖3。

2.4.1 百香果皮DPPH 自由基清除能力分析

由圖3A 可知，四川、廣西和福建百香果皮均具有DPPH 自由基清除能力，差異顯著（P＜0.05）。四川百香果皮多酚提取物表現出最強DPPH 自由基清除能力，SC50為57 μg/mL；廣西樣品DPPH 自由基清除能力（SC50=63 μg/mL）次之；福建樣品DPPH 自由基清除能力相對較弱，SC50為102 μg/mL。Domínguez-Rodríguez等[11]研究發現哥倫比亞地區紫皮百香果皮DPPH 自由基清除能力的SC50為32.93 μg/mL，高于本試驗百香果皮的DPPH 自由基清除能力，而本試驗三產地百香果皮DPPH 自由基清除能力均高于Cao 等[27]所測廣西紫皮百香果皮醇提物DPPH 自由基清除能力（SC50=29.6 mg/mL），結果差異可能與百香果產地、采收時間和處理方式不同有關。

2.4.2 百香果皮ABTS+自由基清除能力分析

由圖3B 可知，四川百香果皮ABTS+自由基清除能力最強，為0.97 mmol TE/g，廣西百香果皮ABTS+自由基清除能力為0.94 mmol TE/g，略低于四川樣品（P＞0.05）。福建百香果皮ABTS+自由基清除能力相對四川、廣西樣品較弱（0.74 mmol TE/g）。三產地百香果皮ABTS+自由基清除能力存在一定差異，但均高于巴西栽培Passiflora setacea 西番蓮籽的種籽油ABTS+自由基清除能力（0.308 μmol TE/g）[28]。

2.4.3 百香果皮FRAP 分析

由圖3C 可知，三產地百香果皮均具有一定的鐵離子還原/抗氧化能力，接近云南特色水果——香椿果（FRAP 值為1.24 mmol Fe2+/g）[29]。四川百香果皮鐵離子還原/抗氧化能力最強，FRAP 值為0.71 mmol Fe2+/g，高于廣西百香果皮鐵離子還原/抗氧化能力（FRAP 值為0.69 mmol Fe2+/g），但差異不顯著（P＞0.05）。四川和廣西百香果皮鐵離子還原/抗氧化能力顯著高于福建百香果皮鐵離子還原能力（FRAP 值為0.34 mmol Fe2+/g）（P＜0.05）。

2.4.4 百香果皮自由基抑制能力分析

由圖3D 可知，三產地百香果皮均可抑制自由基產生從而降低亞油酸氧化速率，但效果低于陽性對照BHT（IC50=0.08 mg/mL）。三產地百香果皮自由基抑制能力差異顯著（P＜0.05），該結果與DPPH 自由基清除能力結果一致。四川百香果皮的IC50值最小，約為4.99 mg/mL，表現出較強抗氧化能力，廣西百香果皮次之（IC50=6.50 mg/mL），福建百香果皮抗氧化能力較弱，IC50值為7.39 mg/mL。

研究證明酚類化合物種類與含量影響其生物學活性[30]，三產地百香果皮抗氧化活性差異可能與各產地酚類化合物種類、含量不同有關。因此進一步開展酚類物質與抗氧化活性的相關性分析，以確定關鍵活性酚類化合物。

2.5 百香果皮酚類物質與抗氧化活性相關性分析

百香果皮酚類物質含量與抗氧化活性相關性分析結果見表3。

表3 酚類物質含量與抗氧化活性相關性分析Table 3 Correlation analysis of phenolic compounds content and antioxidant activities

由表3 可知，總酚含量與DPPH、ABTS+自由基清除能力和鐵離子還原/抗氧化能力呈極顯著相關（P＜0.01），與自由基抑制能力顯著相關（P＜0.05），表明總酚含量對三產地樣品發揮抗氧化能力貢獻大，這與Saravanan等[31]發現總酚對百香果皮抗氧化能力起重要作用的結果一致。蘆丁含量與DPPH、ABTS+自由基清除能力和鐵離子還原/抗氧化能力呈極顯著相關（P<0.01），與自由基抑制能力顯著相關（P<0.05），說明蘆丁是百香果皮總多酚中發揮抗氧化作用的關鍵化合物。葒草素、牡荊素與DPPH、ABTS+自由基清除能力和鐵離子還原/抗氧化能力呈不顯著相關（P>0.05），表明葒草素、牡荊素對百香果皮自由基清除能力和鐵離子還原能力無明顯貢獻，可能是因為三產地百香果皮中葒草素、牡荊素含量遠低于蘆丁含量，分別只是蘆丁含量的8.77%和1.76%，因此抗氧化能力不明顯；同時百香果皮中存在未知酚類化合物及其相互作用，可能會對葒草素、牡荊素發揮抗氧化能力產生影響。

3 結論

三產地百香果皮均含有酚類化合物且表現出較好的抗氧化活性。從四川百香果皮中分離鑒定出7 個酚類化合物，福建5 個，廣西4 個，其中，四川百香果皮含有2 個特有多酚：鞣花酸和芥子酸-O-己糖。三產地百香果皮均含有一定量的葒草素、牡荊素和蘆丁，四川百香果皮蘆丁含量最高，廣西百香果皮蘆丁含量與四川樣品蘆丁含量差異不顯著（P>0.05），福建、廣西百香果皮中葒草素和牡荊素含量差異不顯著（P>0.05）。相比于廣西、福建，四川百香果栽培區日照時間長、海拔高，推測四川百香果受到較強紫外線照射導致果皮積累了更豐富的酚類化合物。三產地百香果皮多酚提取物均表現出較好體外抗氧化能力，但表現出產地差異。相關性分析顯示，總酚對百香果皮發揮抗氧化能力貢獻極高，蘆丁是其中的關鍵活性化合物。以上研究結果表明，我國四川、廣西和福建百香果皮均是酚類化合物的綠色優質來源，四川百香果皮在酚類成分含量和抗氧化活性上更具特色。針對各產地百香果皮酚類成分及活性差異，可根據產業需求選擇符合要求的產地樣品。研究結果為百香果皮開發為功能性食品或天然抗氧化劑提供科學數據，所確定的關鍵活性化合物對百香果皮相關產品深加工和精準開發具有重要指導意義。