大孔樹脂純化核桃分心木多酚及其組分鑒定

許歡歡，苗春霖，宋穎，何愛民，吉洋洋，牟德華，高山*

（1.河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.河北綠嶺康維食品有限公司，河北 邢臺 054300；3.河北省（邢臺）核桃產業技術研究院，河北 邢臺 054300）

核桃分心木（Diaphragma juglandis Fructus，DJF）是一類常見的核桃副產品，存在于核桃內的木質橫隔膜，別名分心木、胡桃夾、胡桃隔，因其味道苦澀，在食品加工中經常被丟棄[1]。DJF 也被廣泛用于傳統醫藥中，包括治療和預防糖尿病、腎虛、腹瀉和泌尿生殖系統疾病等[2]。DJF 中含有豐富的多糖、黃酮、多酚、甾類、單寧、膳食纖維、不飽和脂肪酸等多種成分[3-6]，具有廣泛的生物活性。大孔樹脂吸附-解吸工藝因其易于擴展、價格低廉、可重復使用、無毒、不產生二次污染等優點被開發并廣泛應用于天然產物提取物的分離純化[7]，如酚類、黃酮類、糖苷和皂苷[8-9]。

目前，對DJF 的研究主要集中在粗提物或某些化學成分的定性和定量分析[10]，對核桃分心木多酚（Diaphragma juglandis Fructus polyphenols，DJF-P） 分離純化的研究較少，一定程度上影響了DJF-P 資源的開發利用。前期試驗中發現DJF 可有效抑制炎癥因子NO的釋放，推測核桃分心木發揮抗炎作用的主要成分是槲皮素[11]。槲皮素具有廣泛的生理作用，特別是在誘導細胞凋亡、抑制轉移和抗增殖作用等方面[12-13]。為提高DJF-P 中槲皮素的純度，本試驗篩選出適用于純化分離DJF-P 的大孔樹脂，并優化靜態吸附解吸的工藝條件，以期為開發利用DJF-P、提高核桃資源附加值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DJF：河北省綠嶺康維有限公司；AB-8、HPD-20、D101、HPD-400、ADS-17 型大孔樹脂：天津市天大化工實驗廠；蘆丁、綠原酸、阿魏酸、沒食子酸、槲皮素、兒茶素：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AR64CN 分析天平、DFT-200 高速萬能粉碎機：上海化科實驗器材有限公司；CRE-2000A 旋轉蒸發器：鞏義市英峪高科儀器廠；KQ5200DE 數控超聲清洗機：昆山超聲儀器有限公司；V-500 分光光度計：上海元析儀器有限公司；LC-20 高效液相色譜分析：日本島津公司；Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：北京迪科馬科技有限公司；TDL-5-A 離心機：上海安亭科學儀器廠；CHA-S 恒溫搖床：常州冠軍儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DJF 預處理

將DJF 放入高速萬能粉碎機中進行粉碎，每次打粉15 s，為防止溫度過高兩次打粉間隔1 min，共打粉3 次，過80 目篩得到DJF 粉。

1.3.2 DJF-P 制備

將預處理后的DJF 粉用55%乙醇按照一定料液比[1∶5、1∶15、1∶25（g/mL）]在室溫下浸提24 h，過濾，收集濾液。濾液在60 ℃下負壓旋蒸，濃縮到原體積的1/4，收集濃縮液。將濃縮液用無水乙醇沉淀（體積比為1∶4），在4 ℃冰箱過夜，收集濾液，除去析出的多糖沉淀，得到DJF-P 濃縮液。將DJF-P 濃縮液用55%乙醇稀釋10、20、30 倍，共制備出9 種DJF-P 溶液，在4 ℃下保存備用，制備的9 種DJF-P 溶液見表1。

表1 制備的9 種DJF-P 溶液Table 1 Preparation of nine types of DJF-P solutions

表2 核桃分心木酚類物質HPLC 梯度洗脫程序Table 2 HPLC gradient elution procedure for Diaphragma juglandis Fructus polyphenols

1.3.3 總酚含量的測定

采用楊文娟等[14]的方法，將沒食子酸標準品作為對照，以含量x（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。將DJF-P 濃縮液和DJF-P 溶液按相同方法測定吸光值，根據標準曲線計算總酚含量。

1.3.4 大孔樹脂預處理

參照巫永華等[15]的方法，在使用前，去除在生產過程中殘留在樹脂孔隙中的合成單體、引發劑和致孔劑[16]。取AB-8、HPD-20、D101、HPD-400、ADS-17 5 種不同型號的大孔樹脂，分別加入體積分數為95%乙醇浸泡24 h，再用去離子水洗滌至無醇味。將處理好的大孔樹脂用體積分數為6%的HCl 浸泡3 h，用去離子水洗至中性，再用體積分數為6%的NaOH 溶液浸泡3 h，用去離子水洗至中性，備用。

1.3.5 大孔樹脂的篩選

準確稱取處理過的AB-8、HPD-20、D101、HPD-400、ADS-17 5 種不同型號的大孔樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL DJF-P 5# 溶液提取料液比為[1∶15（g/mL）、稀釋20 倍]，將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率振蕩24 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（1）計算各大孔樹脂吸附率（P，%）。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，加入85%乙醇溶液30 mL，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸12 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率（D，%）[17]。

式中：C0為吸附前DJF-P 的原始濃度，μg/mL；C1為大孔樹脂吸附后DJF-P 的濃度，μg/mL；C2為解吸液中DJF-P 的濃度，μg/mL；V1為粗提物溶液體積，mL；V2為用于解吸的乙醇溶液體積，mL。

1.3.6 AB-8 大孔樹脂靜態吸附與解吸試驗

1.3.6.1 吸附時間對靜態吸附量的影響

稱取4 份經過預處理的AB-8 樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL DJF-P 5# 溶液（提取料液比為1∶15（g/mL）、稀釋20 倍），將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率分別振蕩4、6、8、12 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（1）計算AB-8 大孔樹脂吸附率。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，加入85%乙醇溶液30 mL，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸4、6、8、12 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率。

1.3.6.2 上樣液料液比對靜態吸附量的影響

稱取3 份經過預處理的AB-8 樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL DJF-P 2#、5#、8# 溶液[提取料液比為1∶5、1∶15、1∶25（g/mL），稀釋20 倍]，將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率振蕩8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（1）計算AB-8 大孔樹脂吸附率。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，加入85%乙醇溶液30 mL，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率。

1.3.6.3 DJF-P 稀釋倍數對靜態吸附量的影響

稱取4 份經過預處理的AB-8 樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL 的DJF-P 濃縮液和DJF-P 4#、5#、6# 溶液[提取料液比為1∶15（g/mL），稀釋10、20、30 倍]，將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率振蕩8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（1）計算AB-8 大孔樹脂吸附率。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，加入85%乙醇溶液30 mL，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率。

1.3.6.4 解吸液濃度對靜態解吸率的影響

稱取5 份經過預處理的AB-8 樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL DJF-P 5# 溶液[提取料液比為1∶15（g/mL），稀釋20 倍]，將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率分別振蕩8 h。然后將樹脂過濾后洗去殘留的多酚，放入150 mL 錐形瓶中。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，分別加入30 ml 體積分數為60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率。

1.3.7 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析DJF-P 的組成

通過分光光度計測其在320～380 nm 的吸光度，得到其在346 nm 吸光度最大，因此確定346 nm 為樣品的測定波長。

分別稱取蘆丁、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸、槲皮素5 種標準品各10 mg，用甲醇溶解并配制成1 mg/mL 的單標溶液。各取單標溶液2 mL，配制成混合標準樣品溶液。

HPLC 條件：Diamonsil C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相A：0.1%（體積分數）甲酸水溶液；流動相B：乙睛；流速：0.5 mL/min[18]。

1.4 數據統計分析

試驗數據利用Excel 2010、Origin 2018 進行分析及繪圖，試驗數據以平均值±標準偏差表示，每個試驗至少重復3 次。

2 結果與討論

2.1 核桃分心木總酚的測定

總酚含量標準曲線如圖1 所示。

圖1 總酚含量標準曲線Fig.1 Standard curve of total phenolic content

在760 nm 波長下測定不同濃度沒食子酸的吸光度，將結果做線性回歸，以沒食子酸標品的濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光值（A）為縱坐標。由圖1 可知，標準曲線為Y=0.015 39+0.018 43X（R2=0.997 37）。

2.2 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂的吸附能力受表面積、孔徑和極性的影響。同時，范德華力在復雜吸附過程中起著至關重要的作用。由于不同類型大孔樹脂的表面性質、孔狀結構及與DJF-P 含有的氫基團和苯環之間形成范德華力或氫鍵的能力不同，因而對DJF-P 具有不同的吸附能力[19-20]，試驗中5 種大孔樹脂的理化特性見表3。5 種大孔樹脂對DJF-P 吸附解吸性能比較見圖2。

表3 不同型號大孔樹脂的相關性質Table 3 Relevant properties of different types of macroporous resins

從圖2 可以看出，吸附率較高的大孔樹脂類型為HPD-20、ADS-17，但通過試驗觀察發現這2 種大孔樹脂對色素吸附能力較高，造成試驗數據偏差，導致解吸率偏低的情況；AB-8 型大孔樹脂的吸附率和解吸率表現均優于D101、HPD-400 型大孔樹脂，所以選擇AB-8 大孔樹脂進行后續試驗。

2.3 AB-8 大孔樹脂靜態吸附與解吸試驗

2.3.1 吸附時間對靜態吸附量的影響

吸附過程由不同的階段組成，在吸附階段并不保持穩定。一般來說，目標分子通過傳質從邊界層擴散到大孔樹脂的孔隙中，吸附在大孔樹脂的表面活性位點上。吸附速率與所用的時間、溶劑和吸附劑材料直接相關[21]。按照一定的時間間隔檢測吸附液和解吸液中的總酚含量，并計算出吸附率和解吸率，繪制動力曲線，結果見圖3。

圖3 AB-8 大孔樹脂的時間動力曲線Fig.3 Time-dynamic curve of AB-8 macroporous resin

由圖3 可知，隨著時間的延遲，吸附率整體逐漸增加，初始階段吸附速度較快。到達8 h 后，由于大孔樹脂的表面結合位點大多處于飽和狀態，只觀察到微小的變化，所以吸附時間選擇8 h。解吸過程中，當解吸時間到達8 h 后，解吸率開始下降，可能是由于大孔樹脂出現了復吸現象，重新將多酚從解吸液中吸附至大孔樹脂的表面活性位點上[22]。因此，后續其他因素的優化過程中的吸附時間和解吸時間選擇8 h。

2.3.2 料液比對靜態吸附解吸性能的影響

溶劑比例相對較低時，提取溶液容易達到飽和，溶液體系中的總酚含量較低，隨著溶劑的增加，總酚的溶解更加完全，同時多糖和蛋白質等雜質的溶出也會增加。料液比對靜態吸附解吸性能的影響見圖4。

圖4 料液比對靜態吸附解吸性能的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on static adsorption-desorption performance

由圖4 可知，隨著提取液體積增大，體系中的總酚含量增加，吸附率逐漸升高，解吸率逐漸減小。由于料液比為1∶5（g/mL）時吸附率過低、料液比1∶25（g/mL）時解吸率太低，且吸附率太低會影響對DJF-P 的富集效果，解吸率太低會影響大孔樹脂的再利用功能，因此料液比選擇1∶15（g/mL）。

2.3.3 DJF-P 濃縮液稀釋倍數對靜態吸附解吸性能的影響

吸附液濃度過高時，會縮短大孔樹脂的使用壽命。吸附液濃度過低時，會延長吸附時間。DJF-P 濃縮液稀釋倍數對靜態吸附解吸性能的影響見圖5。

圖5 分心木多酚提取液稀釋倍數對靜態吸附解吸性能的影響Fig.5 Effect of dilution ratio of Diaphragma juglandis Fructus polyphenol extract on static adsorption-desorption performance

由圖5 可知，隨著稀釋倍數的增加，大孔樹脂解吸率先急速升高后逐漸下降，但下降差距較小。由于當DJF-P 濃度過大時體系中的雜質含量也較多，雜質可能阻塞樹脂空隙[23]，也可能與DJF-P 爭奪AB-8 大孔樹脂的活性位點[24]；而低質量濃度的DJF-P 會使AB-8大孔樹脂吸附活性降低。故最佳稀釋倍數為20 倍。

2.3.4 解吸液濃度對靜態吸附解吸性能的影響

由于乙醇毒性低、成本低、易于去除，常被用作大孔樹脂的解吸液[25]。乙醇濃度對靜態吸附解吸性能的影響見圖6。

圖6 解吸液濃度對靜態吸附解吸性能的影響Fig.6 Effect of desorption solution concentration on static adsorption-desorption performance

由圖6 可知，解吸液極性隨著濃度發生改變，乙醇濃度較低時，其相對極性較強，解吸率較低；當乙醇濃度為70%時，極性較為適中，AB-8 大孔樹脂的解吸率最高；隨著乙醇濃度的增加，極性降低，解吸率又有所下降[26]，故解吸液的最佳濃度為70%。

2.4 HPLC 測定多酚含量結果分析

DJF-P 中含有多種多酚類物質，通過HPLC 可以對比分析出經過大孔樹脂純化分離后的物質變化如圖7 所示。

圖7 5 種對照品及DJF-P 純化前后的HPLC 色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of five reference substances and DJF-P before and after purification

由圖7 可知，純化前DJF-P 含有較多雜峰，純化后鑒別出槲皮素的純度大大提高。經過對照標準品色譜分析圖，共檢測出5 種主要的多酚類物質分別為沒食子酸、綠原酸、蘆丁、阿魏酸和槲皮素，其中槲皮素含量最高，純化前槲皮素含量為65.81%，純化后槲皮素含量為97.41%。證明AB-8 型大孔吸附樹脂對DJF-P的純化效果較好。

3 結論

通過靜態吸附和解吸試驗，篩選出最適合分離純化DJF-P 的AB-8 型大孔樹脂，其最佳工藝條件：采用55%乙醇按料液比為1∶15（g/mL）室溫下浸提24 h，過濾，60 ℃旋蒸，收集DJF-P 濃縮液。將DJF-P 濃縮液用55%乙醇稀釋20 倍后，得到DJF-P 溶液。DJF-P 溶液與AB-8 型大孔樹脂振蕩吸附8 h，吸附飽和后，70%乙醇對AB-8 型大孔樹脂振蕩解吸8 h，過濾，得到純化后的DJF-P 溶液。經HPLC 分析，純化前的DJF-P主要成分含有槲皮素、阿魏酸、蘆丁、綠原酸和沒食子酸，其中槲皮素含量最高。純化后DJF-P 中的槲皮素的純度可由65.81%提高到97.41%。DJF-P 中的槲皮素經前人試驗證明具有較強的抗炎作用，本試驗將DJF-P 中的槲皮素純度大大提升，為后續核桃分心木資源的開發利用奠定試驗基礎。