酶解食品源蛋白質(zhì)制備生物活性肽的研究進(jìn)展

張昂，徐威，郭青松

（1.濮陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 濮陽(yáng) 457000；2.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；3.安徽國(guó)肽生物科技有限公司，安徽 宣城 242100）

生物活性肽（bioactive peptide，BP）是嵌入在主要食物蛋白質(zhì)中的特定肽基序，一旦從它們的母體蛋白質(zhì)中釋放出來，能展現(xiàn)出優(yōu)異的似激素或藥物的活性作用，從而在人體健康方面發(fā)揮重要作用[1]。大多數(shù)的生物活性肽在母體蛋白質(zhì)中包含2～20 個(gè)氨基酸的特定多肽序列，雖然不同分子片段的復(fù)雜程度有差異，但生物活性肽的分子量大多都在6 000 Da 以下。食品來源的生物活性肽在開發(fā)功能性食品或保健品以及預(yù)防和管理許多慢性病方面具有巨大潛力。眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽具有抗氧化、降血壓、抗炎、抑菌、抑制血栓形成和提高免疫力等功能[1-3]。

目前，生物活性肽的制備方法主要有化學(xué)提取法、微生物發(fā)酵法、生物合成法和酶解法。化學(xué)提取法能成熟地運(yùn)用于生物活性肽的制備，是4 種方法中應(yīng)用最廣泛的，但提取過程中要消耗大量化學(xué)試劑，同時(shí)存在環(huán)境污染大、設(shè)備成本高等缺點(diǎn)；微生物發(fā)酵法制備的生物活性肽具有成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，但在發(fā)酵過程中發(fā)酵時(shí)間不易控制，且發(fā)酵過程易受微生物感染，會(huì)造成安全問題；利用生物合成法制備生物活性肽具有高純度和成熟的優(yōu)勢(shì)，但這種方法成本較高，產(chǎn)率卻很低；與其他生物活性肽制備方法相比，酶解法具有反應(yīng)過程易控制、重復(fù)性好、成本低、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)多肽，使用不同的蛋白酶切割母體蛋白質(zhì)能產(chǎn)生具有不同活性的肽段。

蛋白質(zhì)分子大多擁有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，這使得蛋白質(zhì)底物與酶的接觸頻率降低，最終使酶解法制備活性肽的應(yīng)用存在一定限制[2]。當(dāng)前研究表明，在酶解前可適當(dāng)改變蛋白質(zhì)底物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，提高酶對(duì)蛋白質(zhì)底物的敏感性，從而達(dá)到提高酶解效率的目的。通過加熱、氧化、高壓、剪切等方式使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞的同時(shí)發(fā)生輕微變性，蛋白質(zhì)發(fā)生解折疊，結(jié)構(gòu)變松散，隱藏在內(nèi)部的酶切作用位點(diǎn)暴露，改善酶解效果。不同的前處理方式對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)造成的影響不同，因而對(duì)后續(xù)酶解法制備活性肽促進(jìn)效果也有差異。本文主要介紹酶解法制備生物活性肽的前處理技術(shù)和酶解產(chǎn)物的結(jié)果和性質(zhì)分析，同時(shí)對(duì)酶解產(chǎn)物的純化及鑒定、肽活性研究方法進(jìn)行綜述，以期為酶解法制備生物活性肽的相關(guān)研究提供參考。

1 預(yù)處理

1.1 化學(xué)法

1.1.1 傳統(tǒng)酸堿處理

作為一種傳統(tǒng)處理方式，酸或堿處理在預(yù)處理過程中運(yùn)用十分廣泛，酸或堿分別能與蛋白質(zhì)的堿性、酸性基團(tuán)結(jié)合，使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部及分子之間的非共價(jià)鍵斷裂，造成蛋白質(zhì)非螺旋結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)的破壞，水分子更容易進(jìn)入螺旋內(nèi)部，水合作用因而加速，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得舒展松散，利于后續(xù)酶解過程。張玲[3]研究了酸處理對(duì)酶法提取羅非魚皮膠原多肽的影響，結(jié)果表明酸預(yù)處理時(shí)間低于4 h 可獲得較高品質(zhì)的明膠。強(qiáng)堿可使蛋白巰基與二硫鍵發(fā)生消除反應(yīng)或交換反應(yīng)，對(duì)蛋白理化特性影響較大；呂瑩等[4]研究了堿處理對(duì)酶法提取核桃肽抗氧化活性的影響，結(jié)果表明經(jīng)過堿液預(yù)處理操作，核桃肽更易與溶液中的酶分子相互作用，肽的抗氧化活性和得率均高于其他處理組。雖然酸堿處理作為預(yù)處理手段能在一定程度上提高酶解效率，但是若酸堿濃度過高或處理時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)共價(jià)鍵特別是肽鍵斷裂，蛋白質(zhì)聚集，不利于后續(xù)的酶解過程。

1.1.2 氧化前處理

氧化是導(dǎo)致水產(chǎn)品質(zhì)量劣化、鮮度下降和風(fēng)味喪失的主要原因之一。水產(chǎn)品中蛋白氧化作用明顯，活性氧的作用、氧化應(yīng)激的二次副產(chǎn)物攻擊都會(huì)造成蛋白質(zhì)氧化。蛋白質(zhì)氧化后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，對(duì)酶的親和力增強(qiáng)，蛋白質(zhì)更易發(fā)生水解、聚合、交聯(lián)作用。有研究表明，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行氧化前處理后，其某些氨基酸殘基會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈發(fā)生交聯(lián)，這可能會(huì)改變蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)，最終起到促進(jìn)酶解的作用。劉晏瑋[5]利用H2O2氧化預(yù)處理藍(lán)蛤，結(jié)果顯示當(dāng)H2O2濃度為5 mmol/L 和20 mmol/L 時(shí)，藍(lán)蛤的水解度從25%提高至26%、27%，如繼續(xù)增加H2O2濃度，藍(lán)蛤水解度降低。這是因?yàn)樵谳^低H2O2濃度時(shí)，H2O2產(chǎn)生的自由基作用于蛋白質(zhì)，攻擊了蛋白質(zhì)的側(cè)鏈，使得蛋白質(zhì)肽鏈的構(gòu)象發(fā)生輕微改變，更有利于酶發(fā)揮作用，提高水解度。有研究表明，溫和的氧化條件可以使蛋白質(zhì)部分疏水性基團(tuán)暴露，從而提高酶的消化率，但在劇烈的蛋白質(zhì)氧化條件下，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生聚合作用，會(huì)損害消化率，降低蛋白質(zhì)的敏感性[6]。

1.2 酶法

當(dāng)樣品基質(zhì)比較復(fù)雜時(shí)，在酶解過程中，各種成分間可能存在干擾，在進(jìn)行酶解操作前利用特定的酶預(yù)處理樣品，可使酶解效率大幅度提高。例如，在酶解動(dòng)物性蛋白時(shí)，脂肪含量對(duì)酶解效率會(huì)產(chǎn)生顯著影響，傳統(tǒng)去除脂肪通常運(yùn)用擠壓或化學(xué)方法，這很容易導(dǎo)致產(chǎn)品污染和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。Yao 等[7]探究脂肪酶預(yù)處理對(duì)提高牛骨蛋白酶解效果影響，結(jié)果表明當(dāng)?shù)孜餄舛?%、初始pH7.5、脂肪酶用量0.08%、40 ℃培養(yǎng)4 h 時(shí)，可使牛骨蛋白的水解率提高8.19%。這是因?yàn)槔弥久割A(yù)處理動(dòng)物蛋白，可以特異性地水解油脂的酯鍵，從而催化油脂的水解，使其游離出長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油，提高酶解效率。與此結(jié)果類似，趙謀明等[8]利用胃蛋白酶前處理大豆蛋白，大豆蛋白回收率、水解度及酶解產(chǎn)物的抗氧化能力指數(shù)分別提高了39.9%、35.9%和38.5%。

1.3 物理法

1.3.1 加熱技術(shù)

熱預(yù)處理過程簡(jiǎn)單，不添加任何化學(xué)試劑，是一種環(huán)境友好型處理方法，能改善酶解處理存在的時(shí)間長(zhǎng)、效率低等問題。酶解前對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)臒犷A(yù)處理可以使蛋白質(zhì)微變性，暴露出可能隱藏的酶切位點(diǎn)，提高酶解效率[9]。美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)氧化反應(yīng)等在加熱過程中都可能會(huì)發(fā)生，這會(huì)造成許多風(fēng)味前體物質(zhì)發(fā)生降解，降解產(chǎn)物會(huì)相互反應(yīng)形成多種揮發(fā)性化合物，從而提高產(chǎn)物呈味特性。加熱溫度和時(shí)間對(duì)風(fēng)味特征具有重要的影響，許多呈味物質(zhì)的變化與加熱溫度和加熱時(shí)間有關(guān)[10]。李學(xué)鵬等[11]研究熱預(yù)處理對(duì)藍(lán)蛤酶解物的影響，結(jié)果表明加熱溫度70 ℃、加熱時(shí)間10 min 時(shí)，有利于降低苦味值。張玲[3]對(duì)低溫脫脂核桃進(jìn)行加熱預(yù)處理，與直接酶解相比，核桃肽的得率從18.46%提高至47.3%。

1.3.2 超聲波技術(shù)

超聲波技術(shù)是基于頻率高于人類聽力閾值（>16 kHz）的機(jī)械波的一種新型非熱物理加工技術(shù)。超聲波產(chǎn)生的效應(yīng)（空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)）可以提高酶解效率，其中空化效應(yīng)是主動(dòng)力，可以促進(jìn)傳質(zhì)并增加底物和酶之間的接觸頻率，改變底物構(gòu)型。在酶解前對(duì)原料進(jìn)行超聲預(yù)處理，可有效提高酶解效率及轉(zhuǎn)化率。Kangsanant 等[12]探究超聲預(yù)處理對(duì)羅非魚蛋白水解物的抗氧化的影響，結(jié)果顯示，70 W 超聲波預(yù)處理30 min 時(shí)，羅非魚水解液清除DPPH 自由基的能力提高了33%，還原能力提高了45%。許晶等[13]利用超聲預(yù)處理大豆蛋白，酶解產(chǎn)物水解度提高了4%，羥自由基清除率提高了8%。但是，超聲波的功率、作用時(shí)間與蛋白質(zhì)水解度不呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，超聲功率過高、超聲時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)破壞蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)和蛋白酶自身結(jié)構(gòu)，使得蛋白酶活性下降，影響酶解效果，從而降低水解率[14]。

1.3.3 超高壓技術(shù)

超高壓處理也被稱為高壓處理或高壓靜壓處理，與傳統(tǒng)的熱處理工藝相比，超高壓技術(shù)不僅能保證食品的質(zhì)地、形狀、色澤，還能保證食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)特性。作為一種新技術(shù)，超高壓被用來處理蛋白質(zhì)溶液，壓力能使蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)和-SH 基團(tuán)部分暴露出來，蛋白質(zhì)在疏水相互作用下逐漸展開，增加肽在酶消化部位的暴露，有利于后續(xù)的酶解。Zhao 等[15]利用400 MPa 超高壓處理蘑菇腳蛋白10 min，肽提取率提升了3 倍，酶解蛋白水解度從11%提高至23%；Garcia-Mora 等[16]利用超高壓處理風(fēng)信子蛋白，在300 MPa壓力作用下，利用Savinas 蛋白酶水解蛋白的水解度提升了近4 倍，這說明高壓會(huì)破壞非共價(jià)和二硫鍵，使得蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性提升，低分子量多肽濃度增加，蛋白質(zhì)水解度增加。

研究表明，當(dāng)前處理作用壓力大于400 MPa 時(shí)，蛋白質(zhì)后續(xù)的酶解水解度反而降低[17]，這是因?yàn)殡S著壓力的增大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變的越來越松散，繼續(xù)增大壓力，蛋白質(zhì)暴露的基團(tuán)又會(huì)以新的疏水相互作用和形成—SH 鍵重新聚集在一起，不利于酶解。

1.3.4 高壓均質(zhì)技術(shù)

高壓均質(zhì)是一種非熱加工技術(shù)，均質(zhì)過程中不添加化學(xué)試劑，同時(shí)它成本低、效率高，因此被廣泛應(yīng)用于食品加工中[18]。高壓均質(zhì)作用下，懸濁液狀態(tài)的物料快速通過特殊結(jié)構(gòu)的狹窄中斷閥間隙，在此過程中，物料受到高速剪切、高頻振蕩、空穴現(xiàn)象和湍流撞擊等機(jī)械力作用，使得物料顆粒尺寸減小、蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)改變、物理化學(xué)性質(zhì)變化[19]。陳劍兵等[20]利用高壓均質(zhì)技術(shù)前處理菜籽蛋白，從0～150 MPa，壓力越大，堿性蛋白酶酶解菜籽蛋白的促進(jìn)效果越明顯，水解度從10%提高至14%，這是因?yàn)楦邏壕|(zhì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散舒展，蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵在高壓均質(zhì)處理后被破壞，更多的肽鍵得以暴露，肽鍵與蛋白酶作用幾率增大，蛋白質(zhì)水解度提升。趙飛[21]利用高壓均質(zhì)處理大豆分離蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)高壓均質(zhì)處理的大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物水解度提高了143%，抗氧化活性顯著提高了30%。

2 酶解產(chǎn)物的純化及鑒定

大分子的蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶酶解后獲得不同分子量的肽段，肽的分子量及結(jié)構(gòu)影響著肽段的生理活性，為獲得活性較高的肽段，需要對(duì)酶解后得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化流程如圖1 所示，通常使用膜分離技術(shù)（超濾、納濾）對(duì)酶解產(chǎn)物中不同分子量大小的組分進(jìn)行初步的分離，利用離子交換色譜或凝膠色譜對(duì)膜分離后顯示出最高活性的組分進(jìn)行二次分離，最后使用反相高效液相色譜對(duì)活性最高的組分進(jìn)行鑒定前的純化。除此之外，鹽析法[22]、電泳法[23-24]、層析技術(shù)[25-27]等也常應(yīng)用于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的純化。

圖1 酶解產(chǎn)物的純化及鑒定流程圖Fig.1 Flow chart of purification and identification of products of enzymatic hydrolysis

純化后的生物活性肽一般需要進(jìn)行氨基酸序列的鑒定及肽鏈結(jié)構(gòu)的表征。通常采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)未知肽鏈進(jìn)行氨基酸序列的鑒定，利用核磁共振、紫外光譜、傅立葉變換紅外光譜等對(duì)肽鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。除此之外，電泳技術(shù)[28-29]、Edman 降解法[30-31]、圓二色譜法[32-33]也可用于活性肽的鑒定。大多數(shù)情況下，研究者們需將上述多個(gè)方法聯(lián)合使用來分離目標(biāo)活性多肽及鑒定肽鏈的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征[34-36]。

3 酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

3.1 活性肽分子量

目前，主流用酶的來源包括3 種：微生物源（堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味酶）；動(dòng)物源（胃蛋白酶和胰蛋白酶）；植物源（菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶）[37]。酶解法制備生物活性肽時(shí)，原料和蛋白酶種類的差異都會(huì)對(duì)酶解產(chǎn)物產(chǎn)生影響，水解度的不同將直接影響酶解產(chǎn)物的分子量。研究表明，相比高分子量的肽段，低分子量的肽段活性更高，這主要是由于小肽很容易通過腸道上皮細(xì)胞進(jìn)而被人體吸收與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作用。

You 等[38]用木瓜蛋白酶酶解泥鰍，比較了不同分子量泥鰍蛋白水解液超濾組分抗氧化能力，分子量小于3 kDa 的多肽組分抗氧化能力最高，可能是小分子量的肽能與自由基結(jié)合得更充分。與此結(jié)果類似，在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性中，小分子的肽顯示出更高的降血壓活性，Ghassem 等[39]用酶解法從鯉魚中制備降血壓肽，其中分子量791.155 Da 和1 085.841 Da 的兩個(gè)片段有很高的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性，IC50值分別為0.45 μmol/L和0.63 μmmol/L。在抗癌活性中，不同來源的抗癌活性多肽的相對(duì)分子質(zhì)量在300～1 950 Da 之間，分子量小的肽段有更高的抗癌活性，相對(duì)分子質(zhì)量較低的多肽具有更大的分子遷移率和擴(kuò)散性，增加了多肽與癌細(xì)胞成分的相互作用，抗癌活性也隨之增強(qiáng)，Umayaparvathi等[40]酶解牡蠣分離出相對(duì)分子質(zhì)量為515.29 Da 的抗癌肽。而鑒定出來的抗菌肽的相對(duì)分子質(zhì)量大多數(shù)大于1 000 Da，Tang 等[41]酶解鳀魚得到分子量為1 104.662 2 Da 的抗菌肽；Ennaas 等[42]酶解大西洋鯖得到相對(duì)分子質(zhì)量分別為1 094.7、1 042.5、1 111.6、1 102.5 Da 的4 種抗菌肽。大多數(shù)抗菌肽都是陽(yáng)離子和兩親性的，具有親水和疏水表面，它們的抗菌作用是通過在微生物膜上形成氣孔或擾亂微生物膜的完整性而引起的。

3.2 活性肽氨基酸組成

肽活性的產(chǎn)生與多肽鏈中疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、酸性或堿性氨基酸以及含硫氨基酸的數(shù)量、在碳鏈中所處的位置密切相關(guān)[43]。疏水氨基酸（纈氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、脯氨酸）可以改善多肽在脂質(zhì)中的溶解度，促進(jìn)多肽與自由基的相互作用，從而提高抑制脂質(zhì)過氧化的能力，除此之外，還可以增強(qiáng)生物膜中的多肽和多不飽和脂肪鏈之間的接觸；芳香氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）能形成一個(gè)稠密的芳香環(huán)，利于多肽對(duì)金屬離子的螯合作用，芳香氨基酸在清除自由基的過程中能向缺乏電子的自由基提供質(zhì)子，形成穩(wěn)定的活性氧物種，有研究表明，含有組氨酸殘基的多肽具有很強(qiáng)的螯合金屬離子、清除羥基自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的能力，主要是因?yàn)榻M氨酸側(cè)鏈上的咪唑基可以參與供氫和電子轉(zhuǎn)移；酸性或堿性氨基酸可以通過帶電的側(cè)鏈基團(tuán)與金屬離子形成絡(luò)合物，從而螯合金屬離子；含硫氨基酸側(cè)鏈上的巰基可以通過提供氫原子清除自由基[43]。

纈氨酸、脯氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸等疏水氨基酸能增強(qiáng)多肽的抗氧化肽活性，色氨酸、苯丙氨酸這兩種芳香族氨基酸的抗氧化活性與它們作為自由基清除劑的能力有關(guān)，而酪氨酸的抗氧化活性歸因于酚作為氫供體的特殊能力，Chen 等[43]酶解大豆蛋白檢測(cè)到6 種抗氧化肽，活性多肽包括5～16 個(gè)氨基酸殘基，N-末端含有疏水性纈氨酸、亮氨酸，氨基酸序列中含有脯氨酸、組氨酸或酪氨酸，通過比較28 個(gè)結(jié)構(gòu)歸屬，發(fā)現(xiàn)脯氨酸-組氨酸-組氨酸三肽單元是影響大豆蛋白水解物抗氧化活性的活性中心。生物活性肽的抗癌活性與其抗氧化活性相關(guān)，因?yàn)楫?dāng)自由基產(chǎn)生時(shí)，氧化就會(huì)發(fā)生，自由基過量會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)和DNA 造成氧化損傷，從而導(dǎo)致癌癥，能增強(qiáng)抗氧化活性的結(jié)構(gòu)在一定層度對(duì)抗癌活性有促進(jìn)作用。ACE 抑制肽的抑制作用完全依賴于酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)和選擇，其N-端或C-端的氨基酸種類不同，對(duì)ACE 抑制肽的抑制作用也不同。甘氨酸、脯氨酸和亮氨酸能增強(qiáng)活性肽的ACE 抑制活性，Lee 等[44]從輪蟲皮膚中提取的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽（脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-脯氨酸），分子量為975.38 Da，在末端含有脯氨酸和亮氨酸，在N-端含有甘氨酸和亮氨酸。此外，C 端的脯氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸以及N-端的纈氨酸和異亮氨酸也顯示出較強(qiáng)的ACE 抑制活性。例如，F(xiàn)ahmi 等[45]從羅非魚鱗片中分離出結(jié)構(gòu)為纈氨酸-異亮氨酸-酪氨酸的降壓肽。抗菌肽中富含疏水性氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及酸性氨基酸谷氨酸），富含甘氨酸殘基的高疏水性肽可結(jié)合富含脂多糖的疏水性細(xì)菌膜，進(jìn)而具有更高的抗菌活性。

表1 為不同來源的多肽的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)。

4 肽活性評(píng)價(jià)方法

目前，評(píng)價(jià)多肽活性的方法主要有化學(xué)方法、體外細(xì)胞生物學(xué)方法和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法。自由基的清除作用、金屬離子的螯合能力、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)都是典型的化學(xué)法評(píng)價(jià)多肽原蛋白肽的抗氧化活性的手段，多肽抑制微生物生長(zhǎng)的能力是常用的評(píng)價(jià)多肽抗菌活性的化學(xué)方法；體外細(xì)胞生物學(xué)方法一般用于評(píng)估多肽對(duì)特定細(xì)胞或細(xì)胞系的活性，比如，可以用基于細(xì)胞的試驗(yàn)來評(píng)估多肽對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制能力；體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)定法用于評(píng)估多肽在生物體內(nèi)的活性，如多肽的降壓活性可以用高血壓的動(dòng)物模型來評(píng)估，肽的抗癌活性可以用癌癥的動(dòng)物模型來評(píng)估。總的來說，體外、體內(nèi)和基于細(xì)胞的試驗(yàn)的組合經(jīng)常被用來評(píng)估生物活性肽的活性，同時(shí)還有其他分析技術(shù)，如質(zhì)譜法和核磁共振光譜法來進(jìn)行結(jié)構(gòu)定性。曹振海等[58]用DPPH 自由基清除率、還原力表征暗紋東方鲀魚皮制備的膠性。王珊珊[59]采用去卵巢大鼠模型，探討魚骨膠原肽對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防。體外細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)苤苯臃从成锘钚噪膶?duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。與體外化學(xué)方法相比，細(xì)胞生物學(xué)分析比化學(xué)分析更具生物學(xué)意義，因?yàn)檫@種方法涉及幾個(gè)方面，包括細(xì)胞對(duì)抗氧化化合物的攝取、分布和代謝。與體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相比，細(xì)胞生物學(xué)可以彌補(bǔ)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法成本高、耗時(shí)長(zhǎng)的缺陷。但是，在細(xì)胞培養(yǎng)過程很容易造成污染，多數(shù)細(xì)胞試驗(yàn)使用的是傳代細(xì)胞，在一定程度上不能反映體內(nèi)的真實(shí)情況。樊金娟等[60]利用大鼠紅細(xì)胞證明了米糠抗氧化肽具有體外抗氧化作用。

5 展望

生物活性肽在各個(gè)行業(yè)有廣泛的潛在應(yīng)用，包括功能食品、營(yíng)養(yǎng)品和藥品。在功能性食品中，可以添加生物活性肽來提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和健康效益。例如，具有抗高血壓活性的肽可以添加到食品中以幫助降低血壓。在營(yíng)養(yǎng)品中，生物活性肽可以作為補(bǔ)充劑來促進(jìn)健康和預(yù)防疾病。在醫(yī)藥方面，生物活性肽可以作為候選藥物來治療各種疾病，如癌癥和心血管疾病。利用酶解法從植物源、動(dòng)物源、微生物源物質(zhì)中制備生物活性肽是當(dāng)前研究較為熱門的領(lǐng)域。但是酶解法制備生物活性肽的技術(shù)還存在一定的問題：1）生物活性肽的分離純化過程存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高的缺點(diǎn)，因此需要開發(fā)更高效、更節(jié)能的分離純化方法，且目前的工作主要集中在活性肽的制備、純化和表征上，而活性肽的結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系還沒有很好地建立起來，活性肽的活性機(jī)制在分子水平上還沒有得到很好的闡述；2）由于缺乏對(duì)活性肽的吸收、分布、代謝、排泄、毒理和致敏等方面的信息，限制其在市場(chǎng)上的生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，活性肽的安全性和質(zhì)量有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。隨著未來科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和這些肽在體內(nèi)的不斷投入研究，這些肽的分子機(jī)制將在全基因水平得到驗(yàn)證。該領(lǐng)域的未來研究應(yīng)集中在以開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的方法制備、純化和鑒定生物活性肽，包括使用高通量篩選方法來識(shí)別新的生物活性肽，以及使用先進(jìn)的分析技術(shù)，如采用質(zhì)譜和核磁共振光譜表征肽。此外，需要進(jìn)行更多地研究來了解生物活性肽的作用機(jī)制，這有助于設(shè)計(jì)和優(yōu)化具有改進(jìn)特性的新肽。最后，改善多肽在體內(nèi)的生物利用度和穩(wěn)定性是一個(gè)關(guān)鍵的研究領(lǐng)域，可以探索使用納米技術(shù)和封裝等策略來改善生物活性多肽對(duì)目標(biāo)組織的傳遞。未來科研領(lǐng)域與產(chǎn)業(yè)界的合作將有利于實(shí)現(xiàn)活性肽商業(yè)化應(yīng)用的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)。