PPAR-γ抑制高糖微環境下NCI-H460細胞增殖的分子機制

胡明亮

（中國醫科大學附屬盛京醫院胃腸營養外科，沈陽 110004）

肺癌是發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，致死率居惡性腫瘤首位［1］。糖尿病患者的腫瘤發生率遠高于非糖尿病人群，且預后較差。高血糖是各類腫瘤發生的重要危險因素［2］，與結直腸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的發生、發展甚至死亡密切相關［3-6］，但目前糖尿病與肺癌的關系仍不明確［7］。因此，探討高糖微環境對肺癌細胞增殖的影響，并深入揭示其分子機制，對指導高危人群的自我防范、開拓治療肺癌的新方法具有重要意義。

炎癥和持續性感染在腫瘤的發生、發展、惡性轉化、侵襲、轉移等不同階段均起關鍵作用。炎癥小體是一類大分子多蛋白復合物，是介導機體多種炎癥反應的重要信號。Nod樣受體蛋白3（Nod like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體被活化后，促使無活性的pro-caspase-1生成有活性的caspase-1，并切割白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18前體，生成有活性的IL-1β和IL-18并釋放到細胞外，啟動炎癥相關的細胞程序性死亡［8］，參與腫瘤細胞的增殖、分化，在腫瘤的發生發展中發揮關鍵作用［9］。本研究利用高糖培養基模擬高血糖微環境，以特異性PPAR-γ激活劑羅格列酮和NLRP3炎癥小體激動劑尼日利亞菌素鈉鹽（Nigericin sodium salt，NSS）處理人大細胞肺癌NCI-H460細胞，探究PPAR-γ對高糖微環境下NCI-H460細胞增殖的影響，探討高糖微環境下肺癌發生發展的分子機制，為肺癌的精準診療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人大細胞肺癌NCI-H460細胞（中科院上海細胞庫），1640培養基［以色列Biological Industries（BI）公司］，胎牛血清（美國Hyclone公司），CCK-8試劑盒（美國Abbkine公司），葡萄糖、甘露醇、DMSO（美國Sigma公司），羅格列酮（美國MCE公司），NSS（美國GLPBIO公司），BCA蛋白濃度檢測試劑盒（中國碧云天生物技術有限公司），NLRP3抗體、caspase-1抗體（美國Abcam公司），IL-1β抗體、IL-18抗體（美國Abbkine公司），PPAR-γ抗體、GAPDH抗體（美國Proteintech公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組：用含10%胎牛血清的1640培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養NCI-H460細胞。待細胞生長至80%～90%后，0.5%胰蛋白酶消化，按1 ∶2傳代培養。分別用5.5 mmol/L葡萄糖（空白組）、5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇（高滲對照組）和30 mmol/L 葡萄糖（高糖組）培養基處理NCI-H460細胞，用終濃度為20 μmol/L的羅格列酮或終濃度為10 μmol/L NSS處理細胞作為實驗組，加入等量的DMSO作為對照組。

1.2.2 CCK-8法測定細胞增殖能力：收集各組NCI-H460細胞，并制成單細胞懸液，以2×103/孔接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養液，培養箱中繼續培養（0、24、48、72 h），加入CCK-8溶液10 μL/孔，在培養箱中繼續孵育1 h，利用多功能酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（optical density，OD）值，并繪制細胞生長曲線。

1.2.3 平板克隆形成實驗：各組NCI-H460細胞處理后，胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以2×103/孔接種于6孔板中，反復吹打并搖勻，使細胞均勻分散，繼續培養至＞50個細胞/集落，4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下計數并分析集落形成數。

1.2.4 Western blotting：各組NCI-H460細胞處理后，RIPA常規提取細胞總蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。蛋白充分變性，取30 μg行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，100 V 50 min轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入NLRP3抗體、caspase-1抗體、IL-18抗體、IL-1β抗體、PPAR-γ抗體（1 ∶1 000稀釋）及GAPDH抗體（1 ∶2 000稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，相應二抗（1 ∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL發光，Bio-rad凝膠成像分析儀掃描分析蛋白豐度。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。實驗數據均由3次獨立實驗結果的±s表示，采用單因素方差分析或t檢驗比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖微環境對NCI-H460細胞增殖的影響

CCK-8及平板克隆形成實驗結果顯示，與空白組和高滲對照組相比，30 mmol/L高糖處理72 h并培養24 h后，高糖組NCI-H460細胞OD值顯著升高（圖1A），克隆形成體積更大、數量更多（圖1B），差異均有統計學意義（均P＜0.05），說明高糖微環境能夠提高人大細胞肺癌NCI-H460細胞的增殖能力。

圖1 高糖微環境對人大細胞肺癌NCI-H460細胞增殖的影響Fig.1 The effect of high-glucose microenvironment on proliferation of human large cell lung cancer NCI-H460 cell

2.2 高糖微環境對NCI-H460細胞炎癥小體的影響

Western blotting結果顯示，與空白組和高滲對照組比較，30 mmol/L高糖處理72 h后，高糖組NLRP3、caspase-1及活性IL-18、IL-1β表達均顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），提示高糖微環境能夠誘導NLRP3炎癥小體活性升高。見圖2。

圖2 高糖微環境對人大細胞肺癌NCI-H460細胞炎癥小體的影響Fig.2 The effect of high-glucose microenvironment on NLRP3 inflammasome of human large cell lung cancer NCI-H460 cell

2.3 高糖微環境對NCI-H460細胞PPAR-γ蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，與空白組和高滲對照組相比，30 mmol/L高糖處理72 h后，PPAR-γ蛋白表達顯著下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），提示高糖微環境可能通過PPAR-γ調控NLRP3炎癥小體的活性。見圖3。

圖3 高糖微環境對人大細胞肺癌NCI-H460細胞PPAR-γ蛋白的影響Fig.3 The effect of high-glucose microenvironment on PPAR-γ protein of human large cell lung cancer NCI-H460 cell

2.4 羅格列酮對高糖微環境下NCI-H460細胞炎癥小體的影響

用特異性PPAR-γ激活劑羅格列酮刺激高糖微環境下的NCI-H460細胞，分析NLRP3炎癥小體相關蛋白表達情況，結果顯示，在高糖微環境下羅格列酮能夠顯著下調NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達，差異均有統計學意義（P均＜0.05），提示PPAR-γ能有效抑制NLRP3炎癥小體的活性。見圖4。

圖4 羅格列酮對高糖微環境下人大細胞肺癌NCI-H460細胞炎癥小體的影響Fig.4 The effect of rosiglitazone on NLRP3 inflammasome of human large cell lung cancer NCI-H460 cell in high-glucose microenvironment

2.5 羅格列酮對高糖微環境下NCI-H460細胞增殖的影響

利用CCK-8細胞增殖檢測試劑盒和平板克隆技術分析高糖微環境下PPAR-γ對NCI-H460細胞增殖能力的影響，結果顯示，與高糖組相比，30 mmol/L高糖+PPAR-γ處理72 h后，NCI-H460細胞OD值在48 h后顯著降低（圖5A），克隆形成體積更小、數量更少（圖5B），差異均有統計學意義（P均＜0.01），說明PPAR-γ能夠抑制高糖微環境下NCI-H460細胞的增殖。

圖5 羅格列酮對高糖微環境下人大細胞肺癌NCI-H460細胞增殖的影響Fig.5 The effect of rosiglitazone on proliferation of human large cell lung cancer NCI-H460 cell in high-glucose microenvironment

2.6 PPAR-γ通過抑制NLRP3炎癥小體影響高糖微環境下NCI-H460細胞增殖

應用NLRP3炎癥小體激動劑NSS聯合羅格列酮處理30 mmol/L高糖培養的NCI-H460細胞并分析細胞增殖情況，結果顯示，與30 mmol/L高糖+PPAR-γ組相比，高糖+PPAR-γ+NSS組NCI-H460細胞OD值在48 h后顯著升高，形成克隆體積更大、數量更多，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。提示NLRP3炎癥小體激動劑NSS能逆轉高糖微環境下PPAR-γ對NCI-H460細胞增殖的抑制作用。見圖6。

圖6 NLRP3炎癥小體介導PPAR-γ在高糖微環境下抑制NCI-H460細胞增殖Fig.6 NLRP3 inflammasome mediates inhibition of PPAR-γ on the proliferation of NCI-H460 cells in high-glucose microenvironment

3 討論

研究［10-12］表明，血糖升高與腫瘤的發病風險、病情進展及預后密切相關。目前普遍認為，高血糖、高胰島素血癥、慢性炎癥、脂質代謝紊亂及性激素水平異常可能是糖尿病患者腫瘤高發的主要危險因素，然而其分子機制尚不明確。因此，積極尋找有效的生物學靶點，對避免腫瘤發生、延緩腫瘤發展、輔助腫瘤治療具有重要的臨床意義。

葡萄糖是腫瘤生長的能量來源，本研究利用高糖（30 mmol/L葡萄糖）培養基模擬體內高血糖微環境處理人大細胞肺癌NCI-H460細胞，結果發現，高糖微環境可顯著增強NCI-H460細胞的增殖能力。研究［13］表明，糖尿病可能通過多種機制影響腫瘤進展，并可能成為肺癌預后不良的危險因素［14］，其中，炎癥是最重要的機制之一。炎癥和持續性感染可能導致各種惡性腫瘤的發生［15-16］，越來越多的證據表明炎癥在腫瘤的發生、發展、血管生成和侵襲中發揮著重要的作用［17-18］。NLRP3炎癥小體與炎癥性疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤等的發生密切相關。NLRP3炎癥小體的效應分子IL-1β和IL-18參與腫瘤細胞的增殖、分化，在腫瘤的發生、發展中發揮關鍵作用。本研究發現，高糖微環境可顯著提高NLRP3炎癥小體相關蛋白如NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達，提示高糖微環境下炎癥小體被激活，可能參與了高糖微環境對腫瘤的影響。

高糖微環境下，腫瘤細胞增殖旺盛，合理降糖對肺癌的治療具有重要的意義。研究發現，胰島素可促進腫瘤細胞增殖和分化，并引起化療耐藥，而治療2型糖尿病的一線口服藥物PPAR-γ配體激動劑羅格列酮不僅能夠有效降低血糖，同時還具有抗腫瘤作用。PPAR-γ具有抑制腫瘤細胞增殖、血管生成等抗腫瘤作用，可降低腫瘤的發病率和死亡率，但具體分子機制尚不清楚［19］。在晚期前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌和睪丸癌等腫瘤中，PPAR-γ表達水平較高［20-23］，但高水平PPAR-γ在腫瘤發生發展中的作用尚不清楚。臨床研究［24］發現，高PPAR-γ水平對結腸癌、宮頸癌、濾泡性甲狀腺癌和食道癌預后有益。體外研究［24-26］發現，PPAR-γ過表達能抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤生長，而沉默PPARγ則逆轉該效應。研究表明，PPAR-γ天然配體15-脫氧-Δ-前列腺素 J2（15-deoxy-Δ-prostaglandin J2，15d-PGJ2）可通過抑制NF-κB誘導腫瘤細胞凋亡。合成的PPAR-γ配體，如阿格列酮、曲格列酮和西格列酮，可通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤生長［23］。此外，西格列酮能夠提高順鉑對卵巢癌的治療效果。本研究發現，高糖微環境下PPAR-γ蛋白表達顯著下調。PPAR-γ通過抑制NLRP3炎癥小體活性發揮抗炎作用，為了明確PPAR-γ是否通過NLRP3炎癥小體影響高糖微環境下肺癌細胞的增殖能力，本研究利用PPAR-γ激活劑羅格列酮處理高糖微環境下NCI-H460細胞，結果發現，羅格列酮能有效抑制NLRP3炎癥小體的活性、下調NCI-H460細胞的增殖能力，而這一作用可被NLRP3炎癥小體激動劑逆轉。以上結果提示，在高糖微環境下，PPAR-γ通過下調NLRP3炎癥小體，抑制NCI-H460細胞增殖。

綜上所述，本研究利用30 mmol/L葡萄糖處理人大細胞肺癌NCI-H460細胞，探討高糖微環境下肺癌發生發展的分子機制。結果顯示，PPAR-γ通過抑制NLRP3炎癥小體活性，減少高糖微環境下NCI-H460細胞的增殖，從而發揮抗腫瘤的作用。以上結果為指導肺癌合并糖尿病患者的治療奠定了理論基礎。