雙酚A及其3種替代物對肝細胞甘油三酯合成的影響

陳陽，高文婷，李肖，姬曉彤，白劍英，2

（1.山西醫科大學公共衛生學院環境衛生學教研室，太原 030001；2.煤炭環境致病與防治教育部重點實驗室，太原 030001）

雙酚A［2，2-bis（4-hydroxyphenyl）propane，BPA］是一種典型的環境內分泌干擾物，廣泛用于生產聚碳酸酯和環氧樹脂等［1-2］。研究［3-7］表明，BPA可增加女性不孕和復發流產率，與肥胖、2型糖尿病、肝功能異常的發生有關，還可增加患癌癥的風險。BPA可通過調節脂肪酸從頭合成相關基因的表達，影響脂質合成［8］，此外，成年小鼠長期接觸BPA會增加其肝臟的脂質含量［9］。越來越多的研究［10-11］表明BPA具有毒性作用，因此，BPA的使用已受到限制。近年來，某些結構上類似于BPA的新型化學物，如雙酚AF［4，4’-（hexafluoroisopropylidene）diphenol，BPAF］、雙酚B［2-bis（4-hydroxyphenyl）butane，BPB］、雙酚S（4-hydroxyphenyl sulfone，BPS）和雙酚F（4，4’-methylenediphenol，BPF）作為BPA的替代品被廣泛使用。研究［12-14］顯示，在水、沉積物等環境介質中均檢測到BPA及類似物。在中國南京高淳區學齡前兒童尿樣中，典型雙酚類似物BPA、BPAF、BPF和BPS的總質量濃度為2～3 113 ng·L-1，與我國深圳和廣州3～11歲兒童的檢測結果一致［15］。

由于BPA及其類似物存在化學結構的相似性，BPA類似物是否安全也受到了廣泛關注。我國的一項流行病學研究［16］發現，暴露于BPS可增加非酒精性脂肪肝（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）的發病率。LIU等［17］研究發現，部分BPA類似物可導致細胞內甘油三酯（triglyceride，TG）合成增多。因此，BPA類似物對肝細胞脂代謝的作用值得深入研究。本研究擬觀察BPA、BPAF、BPB和BPS染毒HL-7702細胞后，細胞內脂質蓄積情況、TG含量及TG合成相關基因的mRNA表達水平，以探討BPA、BPAF、BPB和BPS是否引起肝細胞脂質蓄積，為制定BPA及其類似物的環境衛生標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人正常肝細胞株HL-7702，由陜西中醫藥大學秦緒軍教授惠贈。

1.1.2 主要儀器：Galaxy 170S CO2培養箱（德國Eppendorf公司），Model 680型酶標儀（美國Bio-rad公司），UV-2450型紫外分光光度儀（上海納諾儀器有限公司），line gene 9600型熒光定量PCR儀（杭州BIOER科技有限公司），HFsafe-1200型生物安全柜［力新儀器（上海）有限公司］，高速低溫離心機 Neofuge 15R［力新儀器（上海）有限公司］，倒置熒光顯微鏡 BX51（日本 Olympus 公司）。

1.1.3 主要試劑：BPA、BPAF、BPB、BPS（上海梯希愛化成工業發展有限公司），DMEM高糖培養基（上海金畔生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），二甲基亞砜、胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司），BCA 試劑盒（武漢博士德生物有限公司），油紅O粉末（美國Sigma公司），TG試劑盒（南京建成生物工程研究所），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（上海翌圣生物科技有限公司），反轉錄試劑盒Primer Script RT MASTER Mix、RNA提取試劑RNAiso Plus（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將人正常肝細胞HL-7702接種于DMEM完全培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 實驗分組及染毒：選取對數生長期細胞，接種于細胞培養板并培養。待細胞密度約達80%時，將細胞隨機分為6組，分別為空白對照組，溶劑對照（0.1% DMSO）組，油酸（1 mmol/L OA）組，1、10、50 μmol/L BPA、BPAF、BPB和 BPS組。于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后進行后續相關實驗。

1.2.3 油紅O染色：選取對數生長期細胞接種于6孔板中，按上述分組進行染毒，染毒時每組設置3個平行孔，染毒24 h后，用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，加入60%異丙醇浸洗5 min，加入油紅O工作液浸染20 min（常溫避光），加入蘇木素復染核1 min，倒置顯微鏡下觀察細胞內出現脂滴的情況，并采集圖像。

1.2.4 GPO-PAP酶法測定細胞內TG含量：細胞染毒24 h，用PBS漂洗2次，胰酶消化后，加入1 mL PBS緩沖液制成細胞懸液，其中250 μL于1 000 r/min離心10 min后棄上清，用BCA法測定蛋白濃度，其余750 μL用于測定TG含量。按照文獻［18］的方法，用異丙醇、己烷、乙醚等有機溶劑抽提細胞內脂質。按試劑盒說明書操作步驟進行測定。

1.2.5 實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定肝細胞內TG合成相關基因mRNA的表達

染毒結束后，用PBS清洗細胞2次，加入適量的RNAiso裂解細胞，提取RNA。用超微量紫外分光光度儀檢測總 RNA 濃度和純度，純度范圍為 1.8～2.2。采用20 μL體系反轉錄，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得逆轉錄產物cDNA。以2 μL cDNA為模板，β-actin為內參，使用Line Gene 9600熒光定量PCR儀檢測TG合成相關基因的mRNA表達水平。PCR引物序列見表1。

表1 相關基因引物序列Tab.1 Related gene primer sequences

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 油紅O染色結果

如圖1所示，空白對照組與溶劑對照組細胞內未見紅色脂滴，1 mmol/L OA組細胞內可見有大量紅色脂滴，且紅色脂滴圍繞細胞膜內側邊緣呈環狀分布，說明HL-7702脂肪變性模型建立成功，可作為陽性對照。與空白對照組和溶劑對照組相比，1、10、50 μmol/L BPA組、BPAF組、BPB組和BPS組細胞內均可觀察到大小不等的紅色脂滴。

2.2 細胞內TG含量

如圖2所示，處理HL-7702細胞24 h，與空白對照組和溶劑對照組相比，1 mmol/L OA組細胞內TG含量明顯增加（P＜0.05）；1、50 μmol/L BPA組，10、50 μmol/L BPAF組，1、10、50 μmol/L BPB組和50 μmol/L BPS組細胞內TG含量明顯增加（P＜0.05）。

圖2 BPA及其類似物染毒后肝細胞內TG含量（n=3）Fig.2 Triglyceride content in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

2.3 TG合成相關基因mRNA的表達

如圖3所示，處理HL-7702細胞24 h，與空白對照組和溶劑對照組相比，10 μmol/L BPAF組，1、10 μmol/L BPS組細胞LIPIN2mRNA表達水平升高（P＜0.05），與空白對照組相比，10 μmol/L BPB組細胞內LIPIN2mRNA表達水平升高（P＜0.05）。與溶劑對照組相比，50 μmol/L BPAF組、50 μmol/L BPB組細胞內LIPIN2mRNA表達水平升高（P＜0.05）。

圖3 BPA及其類似物染毒后肝細胞內LIPIN2 mRNA表達水平的變化（n=3）Fig.3 Changes in LIPIN2 mRNA expression levels in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

如圖4所示，處理HL-7702細胞24 h，與空白對照組和溶劑對照組相比，50 μmol/L BPA組、10 μmol/L BPAF組、50 μmol/L BPB組和1 μmol/L BPS組細胞內DGAT2mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與空白對照相比，1 mmol/L OA組細胞內DGAT2mRNA表達水平升高（P＜0.05），10 μmol/L BPB組細胞內DGAT2mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與溶劑對照組相比，10 μmol/L BPA組細胞內DGAT2mRNA表達水平降低（P＜0.05）。

圖4 BPA及其類似物染毒后肝細胞內DGAT2 mRNA表達水平的變化（n=3）Fig.4 Changes in the expression level of DGAT2 mRNA in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

3 討論

BPA及其類似物不僅對神經系統、生殖系統、內分泌系統及免疫系統具有毒性作用，而且對肝臟脂代謝也有一定的影響。但目前關于BPA及其類似物對肝臟脂代謝的研究還較少見。

本研究中，油紅O染色結果發現，與空白對照組相比，1 mmol/L OA 組細胞內有明顯的脂肪蓄積，脂滴數量較多，且大小不等，圍繞細胞膜內側邊緣呈環狀分布，說明油酸用于建立HL-7702細胞脂肪變性模型成功。BPA、BPAF、BPB和BPS染毒不同劑量組細胞內均可觀察到大小不等的紅色脂滴，說明不僅是BPA，BPA類似物也可導致肝細胞內脂肪蓄積。TG含量測定發現，與空白和溶劑對照組相比，1、50 μmol/L BPA組，10、50 μmol/L BPAF組，1、10、50 μmol/L BPB組和50 μmol/L BPS組細胞內TG含量明顯增加，其余各劑量組細胞內TG含量也有增加的趨勢。因此，形態學觀察和定量分析都表明BPA及其類似物BPAF、BPB和BPS均可導致肝細胞內脂肪蓄積，TG含量增加。

LIPIN家族蛋白具有磷脂酸磷酸酶活性，在脂質合成中起關鍵作用。細胞內脂肪酸水平升高時，存在于細胞質中的LIPIN蛋白轉移至內質網（endoplasmic reticulum，ER），與磷脂酸（phosphatidic acid，PA）結合，并催化PA去磷酸化，促進甘油二酯（diacylglycerol，DAG）合成［19］。卞京等［20］研究發現，宮內發育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）大鼠肝臟中LIPIN2mRNA及蛋白表達上調，可引起肝臟脂肪含量增加。孕期營養限制導致后代脂肪組織增多，脂肪細胞中LIPIN1和LIPIN2的過度表達導致TG積累增加［21］。賀真等［22］用MEHP處理人肝癌HepG2細胞，發現LIPIN2基因的高表達使細胞內TG含量明顯增加，其高表達為細胞內TG合成的最后一步提供了更多的底物。二酰基甘油酰基轉移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）是催化TG合成最后一步反應的關鍵酶。DGAT2過表達使野生小鼠肝臟內TG含量增加［23］。ZHANG等［24］研究發現，DGAT2過表達可刺激牛骨骼肌衛星細胞中脂滴形成和TG積累。研究［20］發現，DGAT2mRNA表達水平升高可促進HepG2細胞內TG合成增加。本研究中，BPA及其類似物染毒細胞24 h后，與空白對照組比較，10 μmol/L BPAF組，10 μmol/L BPB組，1、10 μmol/L BPS組細胞內LIPIN2mRNA表達水平明顯升高，50 μmol/L BPA組，10 μmol/L BPAF組，10、50 μmol/L BPB組和1 μmol/L BPS組細胞內DGAT2mRNA表達水平均明顯升高。BPAF、BPB和BPS均可通過上調LIPIN2和DGAT2mRNA表達促進TG合成增加。BPA僅上調DGAT2mRNA表達，說明BPA類似物影響肝細胞TG合成的途徑可能更廣泛，需要進一步研究。

綜上所述，本研究發現BPA可能通過上調DGAT2mRNA的表達促進TG合成的增加，導致人正常肝細胞內脂肪蓄積。不僅如此，BPAF、BPB及BPS還可能通過上調LIPIN2mRNA的表達提供更多的DAG，進一步導致TG合成的增加，因此，BPA替代物的安全性值得進一步探討。