鵪鶉MyoD基因多態性與生長性狀的相關性分析

汪保 朱夢婷 楊華 楊永林 余乾 張文喆

摘要［目的］研究MyoD基因與鵪鶉生長性狀的相關性。［方法］以朝鮮鵪鶉為研究對象，應用HRM技術檢測群體中MyoD基因的多態性，測定其生長性狀，并進行關聯分析；qPCR檢測3種基因型胚胎肌肉組織中MyoD基因的表達量。［結果］MyoD基因在群體中存在AA、Aa和aa 3種基因型，AA和Aa基因型個體的胸圍顯著高于aa基因型（P＜0.05）。胚胎發育的7～15 d均能檢測到MyoD基因表達，MyoD基因的表達量從11 d開始升高，15 d達到峰值。AA和Aa基因型MyoD基因表達量提高速度高于aa基因型。［結論］MyoD基因A等位基因為朝鮮鵪鶉胚胎生長發育的優勢基因，可用于生長發育快的個體基因型育種選擇。

關鍵詞鵪鶉；MyoD基因；多態性；生長性狀；相關性分析

中圖分類號S 837文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）24-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.020

The Polymorphism Detection of MyoD Gene and Correlation Analysis with Growth Traits in Quail

WANG Bao1，ZHU Mengting2，3，YANG Hua2，3 et al

（1.The 4th division ChuangJin Agricultural Development Group Co.，Ltd.of Xinjiang Production and Construction Corps，Kekedala，Xinjiang 835209;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi，Xinjiang 832000;3.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003）

Abstract［Objective］The purpose of this study was to explore the correlation between the different genotypes of MyoD gene and growth traits in quails.［Method］Korean quails were chosen as the research object，HRM technology was used to detect the polymorphism of MyoD gene in quails，and the growth traits were measured.The correlation analysis between growth traits and MyoD gene were analyzed.The mRNA expression of MyoD three genotypes were analyzed by qPCR in muscle tissue in embryonic stage of quail.［Result］The results showed that three genotypes（AA，Aa and aa） of MyoD gene were detected in the quail population.The chest circumference was significantly higher in AA and Aa genotype than aa genotype（P＜0.05）.The results of qPCR showed that MyoD gene expression could be detected at 7-15 d of embryonic development，the level of MyoD gene expression was increased on day 11，and reached a peak on day 15 of embryonic development.The expression level of AA and Aa genotypes was significantly faster than that of aa genotype.［Conclusion］It is speculated that A allele of MyoD gene may be the dominant genotype during the embryonic growth and development of Korean quail，and can be used to genotype selection for rapid growth in quail breeding.

Key wordsQuail;MyoD gene;Polymorphism;Growth trait;Correlation analysis

鵪鶉作為第二大禽類肉制品，在我國及世界各地都有廣闊的市場。隨著消費者對于肉質要求的日益多樣化，人們不再一味地追求瘦肉率，而是喜歡獨特的口感。鵪鶉具有肉質鮮美、營養價值高及獨特的風味，深受消費者歡迎［1］。動物肌肉組織的生長發育從微觀的角度分析是蛋白質增加和細胞增長分化的結果，其過程相對較為復雜，涉及多基因的分子網絡調控過程。MyoD是生肌調節因子（myogenic regulatory factors，MRFs）基因家族成員中唯一在所有的肌細胞中都能夠表達的基因，參與成肌細胞的分化和特化過程，是一種對肌肉組織的生長發育具有重要作用的轉錄因子［2］。

研究表明，MyoD基因參與早期成肌細胞分化和發育，在家禽早期細胞發育中起著重要作用［3］。張久盤等［4］對固原雞CDS區的SNP進行檢測，發現MyoD基因126A>C突變位點可能是影響固始雞生長發育的重要SNP。朝鮮鵪鶉的肌肉纖維早在胚胎時期就已經發育完成，可能受到MyoD等相關基因的調控，但有關其作用機理的研究較少［5］。因此，筆者以朝鮮鵪鶉為研究材料，研究MyoD基因的多態性，分析不同基因型與生長性狀的相關性，利用qPCR技術檢測子代MyoD基因型胚胎肌肉組織中的mRNA表達水平，探討MyoD基因與鵪鶉胚胎肌肉發育之間的關系，以期為鵪鶉的分子育種提供基礎。

1材料與方法

1.1試驗動物與飼養管理120只體重接近、健康狀況良好的8周齡朝鮮鵪鶉購自莒南縣鵪鶉養殖場，包括公鵪鶉20只和母鵪鶉100只。公母分籠飼養，待母鵪鶉體內精液排盡之后用于后續試驗。采用50 cm×60 cm×40 cm折疊式飼喂籠，飼養密度為0.3 m2/只，自由采食和飲水（開始飼喂的前飲水中添加多維緩解應激），鵪鶉日糧為天康飼料科技有限公司的全價配合飼料進行喂養。日糧組成：玉米63.45%，豆粕28.40%，骨粉2.00%，石粉2.00%，預混料1.00%，魚粉3.00%，DL-蛋氨酸0.15%；營養成分：鈣3.00%，總磷0.30%，粗纖維2.00%，粗蛋白19.85%，代謝能11.56 MJ/kg。

夜間提供光照，舍內溫度維持20～23 ℃，每天清掃一次并用消毒劑殺菌，保證良好的空氣質量，確保相同的飼喂環境。試驗期間每日10：00和20：30定時定量飼喂，確保每日剩余飼料量不超過飼喂量的5％。

1.2主要儀器與試劑電子天平（賽多利斯有限公司，德國），PCR儀（SeneoQuest公司，德國），凝膠成像系統（Bio-Rad公司，美國），電泳儀（北京六一生物科技有限公司，北京），高速臺式離心機（日立公司，日本），Light Cycler96熒光定量PCR儀（Roche公司，美國），DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，中國），LC Green飽和熒光染料（Idaho公司，美國）。

1.3樣品采集和指標測定試驗開始第1天隨機分籠后佩戴腳標，并在禁食12 h后測定生長性狀（體重、體斜長、龍骨長、胸圍、脛長、脛圍）。具體測定方法參考《NY/T 823—2004 家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》進行［6-8］。第20天開始將公鵪鶉與母鵪鶉進行自然交配，并于配種后7 d內開始收集種蛋，分批收集不同分組的種蛋，并轉移到孵化箱內。在7～15日胚齡開始采集胚胎肌肉組織，并迅速轉移到-80 ℃冰箱備用。

1.4引物的設計與合成參照雞MyoD基因序列（GenBank登錄號：XM_046943766.1），選取β-actin基因作為內參基因。使用Primer Premier 5.0軟件設計4對引物，其中MyoD-1、MyoD-2用于多態性分析，MyoD-3用于qRT-PCR試驗，引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.5MyoD基因多態性檢測翅下靜脈采集親本朝鮮鵪鶉1 mL全血，參照DNA提取試劑盒的說明書提取血液基因組DNA，通過高分辨率溶解曲線（HRM）分析MyoD基因的群體多態性。PCR反應體系：PCR Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，LC Green飽和熒光染料0.3 μL，dd H2O 12.7 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性 5 min，94 ℃變性 30 s，引物對應的退火溫度30 s，72 ℃延伸 30 s，共40個循環；72 ℃ 10 min。HRM程序：95 ℃變性5 min；40 ℃冷卻1 min 形成雜合體；從 60 ℃ 開始升至95 ℃進行熒光信號的收集，每秒收集25次信號。收集完后冷卻至40 ℃，所有反應只重復1次。

選取3個有多態性的基因PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果與MyoD基因序列進行對比分析。

1.6MyoD基因表達的qRT-PCR分析將公鵪鶉與母鵪鶉進行雜交試驗，根據基因型組建 Ⅰ 組（AA和Aa基因型）和 Ⅱ 組（aa基因型）子代胚胎，采集胚胎肌肉樣品，使用Trizol法提取組織總RNA，參照反轉錄試劑盒使用說明反轉錄為cDNA，反應體系：5×PrimeScript RT Master Mix 8 μL，RNA約1 800 ng（根據濃度計算），加入RNase-free ddH2O補至40 μL。cDNA合成的條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；合成的cDNA置于4 ℃保存。

利用qRT-PCR檢測MyoD基因的相對表達量。20 μL反應體系：SYBR Premix ExTaq （2×）10 μL、cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循壞，每個樣品設3次重復。

1.7數據分析構建最小二乘線性模型：Yij= μ+ Gi+ eij，其中，Yij為性狀觀察值，μ為群體性狀均值，Gi為基因型固定效應，eij為隨機誤差。使用SPSS 21.0統計軟件對基因型與生長性狀進行關聯分析。2組基因型MyoD基因表達量采用t檢驗進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1親本鵪鶉MyoD基因多態性從圖1可見，HRM分型結果，公母鵪鶉群體中MyoD基因均存在AA、Aa和aa 3種基因型。

2.2MyoD基因測序結果對MyoD基因PCR產物測序結果進行比對，發現MyoD基因存在A700G的同義突變（圖2）。

2.3MyoD基因的遺傳多態性由表2可知，在親本鵪鶉群體中，AA基因型個體數高于其他基因型，為優勢基因型，AA基因型頻率為0.56。而母鵪鶉的AA、Aa和aa的基因型頻率分別為0.56、0.28和0.16。親本公母鵪鶉的等位基因A為優勢等位基因，基因頻率分別為0.67和0.70。χ2檢驗表明，公母鵪鶉該基因座偏離Hardy-Weinberg平衡狀態（P＜0.05）。

2.4MyoD基因多態性與生長性狀的關聯分析由表3可知，對朝鮮鵪鶉MyoD基因AA、Aa和aa 3種基因型與生長性狀的關聯分析發現，AA和Aa基因型個體的胸圍顯著高于aa基因型個體（P＜0.05），3種基因型個體的體斜長、龍骨長、脛長和脛圍均差異不顯著（P＞0.05）。

2.5子代鵪鶉胚胎期MyoD基因的相對表達量從圖3可見，Ⅰ 組和 Ⅱ 組鵪鶉在胚胎肌肉發育的7～15 d均檢測到MyoD基因的表達，第7～10天表達水平較低，從11 d開始顯著升高，在15 d達到最高峰；Ⅰ 組（AA和Aa基因型）鵪鶉在11 d之后的表達量增長顯著高于 Ⅱ 組（aa基因型）個體（P＜0.05）。

3討論

MyoD是典型的肌肉發育調節因子，其表達水平與胎兒胚胎期的肌肉生長發育密切相關。MyoD基因調控自身的表達，與其他的生肌因子互相作用，控制或抑制彼此的表達［2，8-9］。MyoD的基因型與基因頻率對肌纖維的發育起著重要的調節作用，并對產肉量和肉品質有重要影響。魏岳［10］對邊雞MyoD基因多態性和生長和屠宰性狀關聯分析發現，MD-4位點對生長性狀有顯著或極顯著的影響，且AA和CC為優勢基因型。該研究通過檢測朝鮮鵪鶉MyoD基因多態性，測序發現MyoD基因存在A700G的同義突變位點存在AA、Aa和aa 3種基因型。關聯分析發現，MyoD基因不同基因型與生長性狀之間有一定相關性，AA和Aa基因型個體的胸圍顯著高于aa基因型個體。因此，推測AA基因型是參與調控鵪鶉胚胎期肌肉發育的優勢基因型，這與魏岳［10］的研究一致。

在家禽胚胎早期，肌纖維的分化就已經完成，MyoD基因控制成肌細胞分化和發育［11-13］。Mok等［14］研究發現，在體節中Myf5首先在HH第9階段的體節和近軸中胚層中表達，隨后在HH 第12階段表達MyoD，在HH第14階段表達Mgn和MRF4；在四肢肌肉中HH第22階段前肢中首先檢測到Myf5表達，在HH第23階段檢測到MyoD表達，在HH第24階段檢測到Mgn表達，在HH第30階段檢測到MRF4表達。該研究結果表明，Ⅰ 組鵪鶉和 Ⅱ 組鵪鶉在胚胎肌肉發育的7～15 d均檢測到MyoD基因表達，但7～10 d表達水平較低，從11 d開始顯著升高，在15 d達到最高峰。AA和Aa基因型鵪鶉在11 d之后MyoD基因的表達量顯著高于aa基因型個體，并且2組個體MyoD基因的表達均表現出相似的增長趨勢，但AA和Aa基因型的增長幅度較為顯著。

4結論

朝鮮鵪鶉MyoD基因存在A700G同義突變位點，AA和Aa基因型個體的胸圍顯著高于aa基因型個體，MyoD基因在胚胎肌肉發育的11 d以后開始發揮作用，攜帶A等位基因的個體MyoD基因表達量高，生長發育快。

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