山藥中尿囊素對環磷酰胺誘導卵巢功能早衰的保護作用

王小蘭,李 方,孫 墨,王笑陽,馮衛生,3*

1河南中醫藥大學中醫藥科學院;2河南中醫藥大學藥學院;3河南省中藥開發工程技術研究中心,鄭州 450046

卵巢功能早衰(premature ovarian failure,POF)是婦科內分泌系統的常見疾病。近年來,育齡婦女POF發病率上升,卵巢功能下降嚴重影響患者的生存質量,并且顯著增加心血管疾病、骨質疏松及代謝紊亂等相關疾病的風險。在癌癥和系統性紅斑狼瘡患者中,POF與環磷酰胺(cyclophosphamide,CP)在臨床上的應用密切相關[1,2],CP可通過氧化應激[3]、激素[4]的分泌和炎癥[5]來干擾卵巢功能,尋找一種安全有效的卵巢功能保護劑是后續臨床藥物研發的關鍵。

山藥作為傳統藥食同源的中藥材之一,含有豐富的甾體皂苷類、多糖、尿囊素、黃酮類和酚苷類等活性成分,其化學成分的多樣性使其擁有多種藥理作用,如抗氧化、抗炎、免疫調節、降尿酸、抗腫瘤和在腎病方面的治療作用等。研究顯示,開發利用藥食同源的中藥材與天然產物,在保護卵巢方面具有重要意義[6]。尿囊素(allantoin,ALL)是山藥中的主要活性成分[7],具有抗應激[8]、抗炎[9]、調節腸道菌群[10]、促進細胞生長[11]等作用。在前期研究中,課題組通過子宮組織中雌激素受體α和G蛋白偶聯雌激素受體的表達發現山藥和ALL具有雌激素樣作用[12,13],天然植物雌激素對大鼠卵巢卵泡發育有積極作用[14,15],因此,本研究采用CP誘導的卵巢功能早衰大鼠模型,探討ALL改善POF大鼠體內激素水平、卵泡發育與成熟水平,并從氧化應激的角度探討其改善POF的作用機制,為山藥及其活性成分ALL在女性生殖保護方面的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品與試劑

懷山藥(鐵棍山藥的無硫飲片)購自焦作市藥材生產基地(批號:20190415),經河南中醫藥大學藥學院陳隨清教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。

環磷酰胺注射劑(江蘇盛迪醫藥有限公司,純度:95.0%～105.0%,批號:18092626);柱層析填料Diaion HP-20(日本三菱化學公司,批號:6L507);MCI Gel CHP-20(日本三菱化學公司,批號:8H801);Toyopearl HW-40(日本TOSOH公司,批號:40HWFD001FA),Sephadex LH-20(瑞典GE Healthcare公司,批號:10265067);柱層析所用硅膠H(160～200目)、薄層層析硅膠(顆粒范圍10～40 (m)(青島海洋化工廠,批號:0190168,0190221);戊酸雌二醇(仙靈藥業有限公司,批號:19050721);雌二醇(estradiol,E2)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)與促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號分別為:E-EL-0152c、E-EL-R0391c、E-EL-R0026c);超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)與丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號分別為:20200620、20200421、20200514);兔多克隆抗體Nrf2、NQO1(美國Abcam公司,批號:ab137550、ab80588)和小鼠多克隆抗體HO-1(美國Thermofisher公司,批號:MA1-112);β-actin兔多克隆抗體(武漢三鷹生物科技有限公司,批號:22915-1-AP);實驗大小鼠配合顆粒飼料(北京華阜康生物科技有限公司,批號:2010220410)

1.1.2 動物

SD大鼠(雌性,8周齡,體重200±10 g),北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證:SCXK(京)-2016-011,動物質量合格證號:114007002 01620,動物飼養于IVC獨立通風設備,溫度22±2 ℃,濕度(60±5)%。動物實驗過程符合相關倫理要求,已通過河南中醫藥大學倫理委員會審核,倫理審批號:DWLL2018080003

1.1.3 儀器

萬分之一天平(Mettler Toledo公司,型號:AB204-N);蛋白快速轉膜儀(BIO-RAD 公司,型號:Trans-Blot?Turbo);超靈敏多功能成像儀(GE公司,型號:Amersham Imager 600 );酶標儀(BIO-RAD公司,型號:iMarkTM);核磁共振儀(Bruker公司,型號:AVANCE Ⅲ 500);紫外分光光度計(美國熱電公司,型號:EVO300);高速低溫冷凍離心機(美國熱電公司,型號:ST16R)。

1.2 方法

1.2.1 山藥中的尿囊素分離及鑒定

懷山藥(10 kg),采用75%含水乙醇組織破碎提取,過濾,合并濾液后減壓濃縮,加以1∶1比例加適量水分散溶解后,離心除去不溶物,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇經過5次萃取,分別得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。乙酸乙酯部位和正丁醇部位通過Diaion HP-20大孔吸附樹脂、硅膠、Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40、MCI Gel CHP-20、ODS色譜柱,并結合制備液相和重結晶的方法得到單體化合物尿囊素19.7 mg,利用波譜學方法(NMR)和化合物的理化性質鑒定其結構。

1.2.2 動物實驗及分組

適應性喂養1周后。實驗動物按照體重均衡原則隨機分為5組,每組10只,分別為正常對照組(NC),卵巢功能早衰模型組(POF):采用腹腔注射環磷酰胺 75 mg/kg誘導大鼠POF模型。戊酸雌二醇(estradiol valerate,EV)陽性對照組給予EV 0.08 mg/kg,ALL高劑量(ALL-H)組給予ALL 140 mg/kg,ALL低劑量(ALL-L)組給予ALL 70 mg/kg,NC組與POF組給予等體積的蒸餾水,大鼠連續灌胃給藥14 d,1次/d。

1.2.3 大鼠標本取材與卵巢指數的測定

每周記錄大鼠體重變化,末次給藥后大鼠禁食12 h,異氟烷吸入麻醉后,采用負壓采血管腹主動脈取血;于4 ℃條件下3 000 r/min,離心15 min,取上層血清,-80 ℃冰箱備用,打開大鼠腹腔,找到Y型子宮,沿子宮找到花形形狀的卵巢,取出卵巢組織,剔除脂肪后稱重,計算卵巢指數,卵巢指數的計算公式:卵巢指數=(單個卵巢重量/大鼠體重)× 100%。

1.2.4 大鼠生化指標的測定

采用酶聯免疫吸附分析(Elisa)試劑盒測定血清中的E2、LH、FSH,所有實驗操作均按照試劑說明書進行;大鼠卵巢組織用生理鹽水清洗,濾紙擦干后,取卵巢組織50 mg,按試劑盒比例要求加入0.9%生理鹽水,組織勻漿后,3 500 r/min,4 ℃離心10min,取上清。按試劑盒說明書測定勻漿中SOD、MDA、GSH-Px含量。

1.2.5 大鼠卵巢組織病理學觀察

采用4%多聚甲醛固定的卵巢后,經過脫水,石蠟包埋,連續切片,蘇木精伊紅(H&E)染色后,于光學顯微鏡下觀察卵巢組織的形態學變化,觀察內容包括卵巢的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡及黃體數的變化。

1.2.6 大鼠卵巢免疫組化的測定

樣本按照“1.2.5”項下在制成切片后,PBS中3% H2O2溶液中孵育以滅內源性過氧化物酶活性后,滴加Ultra V Block后,用Nrf2一抗(1∶500)孵育2 h,然后在PBS中洗滌2次,每次5 min。然后,在37 ℃下將生物素化的二抗添加到切片中1 h,然后將載玻片暴露于鏈霉親和素過氧化物酶和顯色劑。每次處理后,將載玻片在PBS中清洗。然后用DAB試劑盒顯影切片,用電子顯微鏡觀察并拍照。利用Image Pro Plus 6.0軟件對照片進行分析(每組取3張石蠟切片,每張切片6張照片)。

1.2.7 大鼠卵巢組織氧應激蛋白的表達的測定

組織中提取蛋白質,并使用BCA蛋白測定試劑盒測定濃度。等量的蛋白質樣品通過SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上。將膜在5%(V/V)的脫脂牛奶中在TBST中室溫封閉2 h,然后用一抗HO-1(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)、β-actin(1∶3 000)在4 °C過夜。膜在TBST中洗滌后,室溫下用二抗孵育1 h。PBST洗膜3次,每次5 min,最后用PBS洗5 min,待膜干后用近紅外熒光顯影。

1.2.8 數據處理

2 實驗結果

2.1 山藥中尿囊素的分離與鑒定

白色粉末;mp.105 ℃;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:10.51(1H,s,H-1),8.02(1H,s,H-3),6.89(1H,t,J=6.5 Hz,NH-4),5.77(2H,s,H-8),5.23(1H,d,J=8.0 Hz,H-6);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:156.7(C-2),62.4(C-4),173.6(C-5),157.3(C-6)。以上數據與文獻[16]報道基本一致,故確定該化合物是尿囊素(結構見圖1),經高效液相色譜檢測純度98.10%。

圖1 尿囊素的結構 Fig.1 Structure of allantoin

2.2 尿囊素對卵巢功能早衰大鼠卵巢指數的影響

由圖2可知,與NC組相比,POF組卵巢指數顯著降低(P<0.05)。給藥14 d后,與POF組相比,EV可以顯著增加卵巢指數(P<0.05),ALL-H能顯著改善POF大鼠的卵巢萎縮(P<0.05)。ALL-L對卵巢指數也有影響,但無明顯差異(P> 0.05)。

圖2 尿囊素對大鼠卵巢指數的影響Fig.1 Effect of ALL on ovarian index in 注:與NC組比較,*P <0.05,**P<0.01;與POF組比較,#P <0.05,##P<0.01,下同。Note:Compared with NC group,*P <0.05,**P<0.01;Compared with POF group,#P<0.05,##P <0.01,the same below.

2.3 大鼠卵巢組織病理形態的影響

由圖3可知,POF組閉鎖卵泡數量較NC組明顯增加,成熟卵泡、原始卵泡和次生卵泡較少。經過連續給藥14 d后,與POF組相比,EV組與ALL組閉鎖卵泡數量明顯減少,成熟卵泡、原始卵泡和次生卵泡明顯增加;其中ALL-H組的POF大鼠卵泡數量明顯比在劑量ALL-L組的較多,提示:ALL-H對POF大鼠的卵巢功能障礙的改善較佳。

圖3 大鼠卵巢病理學檢查Fig.3 Pathological examination of rat ovary注:CL:黃體;SF:次級卵泡;Pr:初級卵泡;AF:閉鎖卵泡Note:CL:Corpus luteum,SF:Secondary follicles,Pr:Primary follicle,AF:Atretic follicle.

2.4 對大鼠血清激素的影響

由圖4可知,POF大鼠血清E2水平較正常大鼠明顯降低(P<0.01),FSH水平與LH水平明顯高于正常大鼠(P<0.01)。連續給藥14 d后,與POF大鼠相比,ALL和EV可以顯著提高POF大鼠血清中E2水平,降低FSH和LH水平(P<0.01或P<0.05),ALL-H 對POF大鼠血清中激素的改善作用最佳。

圖4 ALL對POF大鼠血清激素水平的影響Fig.4 Effects of ALL on hormone levels in the serum of POF

2.5 對大鼠卵巢抗氧化能力的影響

由圖5可知,POF組大鼠與NC組比較,SOD、GSH-Px水平顯著降低(P<0.01), MDA水平顯著升高(P<0.01)。連續給藥14 d后,與POF組相比,ALL可以提高POF大鼠SOD、GSH-Px水平,抑制MDA水平(P<0.01或P<0.05)。

圖5 ALL對POF大鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px與MDA含量的影響Fig.5 Effect of ALL on SOD,GSH-Px and MDA contents in ovarian tissue of POF

2.6 對大鼠卵巢Nrf2蛋白表達的影響

由圖6可知,在卵巢組織切片中免疫組化結果顯示,與NC組相比較,POF組大鼠卵巢組織中的Nrf2蛋白表達降低(P<0.01);連續給藥14 d后,與POF組相比較EV組和ALL-H組Nrf2蛋白表達顯著升高(P<0.01),而ALL-L組無明顯差異(P> 0.05)。

圖6 ALL 對POF大鼠卵巢組織中Nrf2蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of ALL on protein expression levels of Nrf2 in the ovarian tissues of POF

2.7 對大鼠卵巢組織中HO-1 與 NQO1蛋白表達的影響

由圖7可知,與NC組相比,POF組HO-1表達顯著降低(P<0.01),而NQO1的表達則沒有顯著性差異(P> 0.05);連續給藥14 d后,EV與ALL-L可以顯著升高POF大鼠卵巢組織中NQO1表達水平(P<0.01);而對HO-1的表達,EV則沒有升高的作用(P> 0.05),ALL-H可以顯著升高HO-1水平(P<0.01)。提示,在CP誘導的大鼠卵巢損傷模型中,對NQO1影響不明顯,但是ALL在POF大鼠的卵巢組織NQO1與HO-1的表達均起到了一定的作用,并因其劑量不同所表達水平也是不同的。

3 討論與結論

環磷酰胺(CP)是一種廣泛用于治療惡性腫瘤和自身免疫性疾病的化療藥物,但其毒副作用強,可對卵巢造成永久性損害[17]。在過去的幾十年里,在癌癥治療過程中,生殖能力的保護以及卵巢功能的恢復變得非常重要,因為這種方案的治療可以提高女性癌癥患者的生活質量[18]。此外,CP還可以通過激活氧化應激標志物和過度消耗抗氧化防御機制影響心臟和腎臟等主要器官[19,20],因此,通過調節氧化應激改善CP對器官的損傷為本研究的關注點之一[21]。

CP的毒性與其代謝產物之一丙烯醛的產生有關,而癌癥患者經過CP治療后,谷胱甘肽(glutataione,GSH)則明顯降低,可能是因為丙烯醛與之相結合的結果,GSH是一種三肽,是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑[22]。與此同時,CP還改變健康卵巢組織中其他內源性抗氧化劑的活性,如SOD,促進卵巢細胞內自由基損傷[23,24]。在本研究中,ALL可顯著保護大鼠卵巢免受CP引起的氧化應激。ALL是嘌呤降解產生的代謝物,存在于動植物體內,可促進皮膚細胞生長與傷口愈合,刺激成纖維細胞生長,并且具有雌激素樣作用,因此本研究在探究其保護器官損傷的同時,也重點關注了其抗氧化作用以及作用途徑。在本研究中,70 mg/kg和140 mg/kg的尿囊素可以保持卵巢GSH-Px和SOD活性,并可以顯著抑制MDA,保護大鼠卵巢免受CP誘導的氧化應激造成的卵巢損傷。

核轉錄因子Nrf2屬于CNC亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族,通過誘導抗氧化活性保護蛋白編碼基因,調節細胞內環境的氧化-脫氧反應[25]。Nrf2通過結合抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)激活下游的抗氧化蛋白和酶,并保護抵御氧化應激[26]。在本研究中,我們發現POF大鼠卵巢中Nrf2的表達降低,氧化應激增加;ALL則在一定劑量下調節Nrf2的水平。研究表明,下游靶基因(HO-1、NQO1等)的表達與Nrf2核易位一致,這不僅證實了Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like associated protein 1,Keap1)-Nrf2-ARE通路的參與,也表明HO-1和NQO1在維持氧化還原穩態中起著關鍵作用[27]。HO-1是血紅素加氧酶的一個亞型,容易被刺激誘導,起間接抗氧化作用[28]。NQO1能清除超氧陰離子自由基,緩解氧化應激[29]上調的活性氧(reactive oxygen species,ROS)過度積累。在我們的研究中,POF大鼠模型對其卵巢中NQO1的表達并不明顯,但是經過連續給藥14 d后,陽性藥EV與ALL在劑量70 mg/kg時,可以顯著升高NQO1表達水平,提示其可能在卵巢損傷應激中也起到了積極的作用,這種結果可能與NQO1的穩定性、雙活性位點以及非酶活性相關[30],可能CP的刺激并沒有激活NQO1,而ALL在一定的劑量下可以與活性位點結合,因此還需要我們進一步地去研究探討。POF大鼠模型對卵巢中HO-1的表達明顯降低,陽性藥EV與ALL在劑量140 mg/kg時對HO-1的表達有明顯的改善作用。HO-1是一應激反應蛋白,能催化血紅素蛋白降解與轉化為膽紅素,分解代謝的產物具有抗氧化,抗凋亡以及免疫調節作用,因此,HO-1在應激狀態下可以發揮保護作用,提示:ALL是可能通過調控HO-1發揮抗氧化應激作用,改善POF大鼠卵巢損傷,本研究中氧化應激對于NQO1途徑的影響,還需進一步地研究。

ALL提高了POF大鼠卵巢組織中HO-1、Nrf2的表達,緩解氧化應激,調節激素水平,改善POF大鼠卵巢功能障礙,本研究為山藥及其活性成分ALL的開發和利用提供參考依據。