甘草酸苷對對乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷的保護作用

史莉萍 李 文 林沁華

（贛南衛生健康職業學院藥學系，江西 贛州，341000）

對乙酰氨基酚是廣泛應用于解熱鎮痛的一大類非甾體類抗炎藥， 但對乙酰氨基酚的中間代謝產物N-乙酰苯醌亞胺（N-acetyl-1，4-benzoquinoneimine，NAPQI）具有肝細胞毒性[1]。因患者不遵醫囑、誤服或者過量服用等，可造成急性肝損傷（acute liver injury，ALI）甚至肝衰竭，且由對乙酰氨基酚引發的ALI 呈上升趨勢。對乙酰氨基酚已成為導致藥物性肝損傷最常見的藥物之一，并成為歐美等發達國家引起急性肝衰竭的首要因素[2]。但是目前臨床上用于治療對乙酰氨基酚所致ALI 的有效藥物和措施不多，且公認的解毒藥N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）具有一系列不良反應[3-5]。因此，尋找理想的肝保護藥物，降低對乙酰氨基酚在使用中的肝臟毒性具有重要的臨床意義。甘草是豆科植物甘草的根及塊狀莖，是一種常見的中藥，有清熱解毒、補脾益氣、鎮咳怯痰的作用，而甘草酸苷為其主要活性成分之一。現代研究表明甘草酸苷具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、保護肝臟的作用[6-7]。已有學者研究提示甘草酸苷對對乙酰氨基酚介導的肝損傷具有保護作用[8-9]，但其作用機制仍有待深入探討。因此，本研究通過實驗驗證甘草酸苷對對乙酰氨基酚所致ALI 小鼠的肝臟保護作用并探討其具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康昆明種雌性小鼠24 只、雄性小鼠24 只，SPF 級，體質量25～35 g，中山大學中山醫學院實驗動物中心提供。實驗期間均遵守本單位實驗動物中心的管理規范照料和使用原則。

1.2 藥品與試劑

對乙酰氨基酚注射液（生產企業：合肥中龍神力動物藥業有限公司，獸藥字120152532，規格10 mL:1 g），取適量對乙酰氨基酚溶于少量氯化鈉溶液，然后補足氯化鈉溶液配制成400 mg/mL 溶液備用[10]；注射用甘草酸苷（ 生產企業：瑞陽制藥有限公司，國藥準字H20060537）；聯苯雙酯（生產企業：浙江海翔川南藥業有限公司，國藥準字H20153110）。藥用級橄欖油（生產企業：通化德濟參藥業有限公司，規格：500 mL/瓶）；0.9%氯化鈉溶液、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒（賴氏法）（規格：96T）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）測試盒（微板法）（規格：96T）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測試盒（微板法）（規格：96T）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）測試盒（規格：96T）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）測試盒（規格：96T）、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（微板法）（規格：96T）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（羥胺法）（規格：100管/96 樣）、丙二醛(A)測定試劑盒(TBA 法)（規格：100 管/96樣）；免疫組化用蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染液（規格：50ml*2）（生產企業：南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 主要設備與儀器

醫用離心機（生產企業：湖南赫西儀器裝備有限公司，型號：DD5 型）；酶標儀（生產企業：南昌普朗醫用設備有限公司，型號：DNM-9602 型）；自動脫水儀（生產企業：北京中瑞祥科技有限公司，型號：ZRX-29768 型）；石蠟切片機（生產企業：美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號：HM340E 型）；光學顯微鏡（生產企業：日本Olympus 株式會社，型號：CX43型）；蛋白質凝膠電泳儀（生產企業：北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN 型）。

1.4 建模、分組給藥與實驗動物處理

對乙酰氨基酚腹腔注射建立ALI 小鼠模型，質量濃度400 mg/mL、劑量1 mL/100 g 小鼠體質量，其中對乙酰氨基酚配置方法：取適量對乙酰氨基酚溶于少量氯化鈉溶液，然后補足氯化鈉溶液，使質量終濃度為400 mg/mL[10]。將造模成功的小鼠采用隨機數表法分為模型組、聯苯雙酯組、甘草酸苷低劑量組、甘草酸苷中劑量組、甘草酸苷高劑量組，另設置對照組（建模時對照組僅腹腔注射1mL/100 g 小鼠體質量的氯化鈉溶液），各8 只。聯苯雙酯組予以60 mg/kg 聯苯雙酯灌胃，甘草酸苷低、中、高劑量組分別予以50、100、150 mg/mL甘草酸苷灌胃（劑量均為1 mL/100 g 小鼠體質量，其中甘草酸苷低劑量組為臨床等效劑量，甘草酸苷中劑量組為臨床等效劑量×2，甘草酸苷高劑量組為臨床等效劑量×4），聯苯雙酯和甘草酸苷均以四氯化碳橄欖油為溶劑。給藥24 h 后取眼眶靜脈血，后頸椎脫臼法處死，迅速剝離肝臟組織。血樣用于檢測肝功能、炎性反應指標；肝臟組織用于肝臟病理觀察。

1.5 肝功能指標及炎癥指標檢測

將小鼠血液樣本以4 000 r/min 離心10 min 分離血清。按照試劑盒說明書，酶標儀檢測各孔吸光光度值，根據標準曲線計算各組血清ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6 水平。

1.6 肝組織病理變化觀察

取各組小鼠左肝葉肝臟組織，制成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 組織塊，采用10%甲醛溶液固定。24 h 后自動脫水儀脫水，后石蠟包埋、切片（層厚5 μm）。恒溫烤干，以二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，采用HE 染色。于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 肝組織氧化應激測定

取各組小鼠肝組織，冰上勻漿，加入0.9 %氯化鈉溶液，3 000 r/min 離心10 min，取上清。按照試劑盒說明書，測定肝組織GSH、SOD。

1.8 統計學分析

采用SPSS 25.0 對所得數據進行統計學分析。計量資料經檢驗均符合正態分布，采用（±s）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，比較采用t 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 聯苯雙酯和甘草酸苷對小鼠肝功能的影響

與對照組比較，模型組血清ALT、AST、LDH 水平均升高（P<0.05）；與模型組比較，聯苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均降低（P<0.05）；與聯苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均降低（P<0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠血清肝酶濃度

2.2 聯苯雙酯和甘草酸苷對小鼠血清炎性因子的影響

與對照組比較，模型組血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P<0.05）；與模型組比較，聯苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均降低（P<0.05）；與聯苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均降低（P<0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠炎癥因子水平

2.3 聯苯雙酯和甘草酸苷對小鼠肝組織病理的影響

對照組中肝小葉結構完整，中央靜脈形態完好，肝竇未見充血或擴張，肝細胞形態及排列正常，未見明顯空泡樣變和水樣變，為0 級損傷。相較對照組，模型組小鼠肝組織HE染色切片有明顯的肝小葉結構改變和肝索間隙擴張，中央靜脈淤血，部分區域可觀察到肝細胞脂肪樣變、水樣變等病理性改變，并伴有炎性反應細胞浸潤，達到Ⅲ級肝損傷。與模型組相比，甘草酸苷低劑量組肝組織結構改變減輕，肝小葉形態變化減輕，中央靜脈附近和肝細胞間有部分炎性反應細胞浸潤；甘草酸苷中劑量組和聯苯雙酯組肝組織結構和肝小葉形態輕微改變，中央靜脈附近和肝細胞間少有炎性反應細胞浸潤；甘草酸苷高劑量組肝組織結構和肝小葉形態接近正常，中央靜脈附近和肝細胞間基本沒有炎性反應細胞浸潤，未見肝細胞脂肪樣變、水樣變，見圖3。

圖3 小鼠肝組織HE 染色切片（×100）

2.4 聯苯雙酯和甘草酸苷對小鼠肝組織GSH、SOD 的影響

與對照組比較，模型組GSH、SOD 活性均降低（P<0.05），MDA 活性升高（P<0.05）；與模型組比較，聯苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組GSH、SOD 活性均升高（P<0.05），MDA 活性均降低（P<0.05）；與聯苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組GSH、SOD 活性均降低（P<0.05），MDA 活性均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組GSH、SOD 活性均升高（P<0.05），MDA 活性降低（P<0.05），見圖4、5。

圖4 各組小鼠肝組織GSH、SOD 活性

圖5 各組小鼠肝組織MDA 活性

3 討論

對乙酰氨基酚是臨床常用的解熱鎮痛藥之一，過量使用將導致其毒性代謝產物在體內蓄積，進而導致肝損傷甚至肝衰竭[11-13]。聯苯雙酯是目前常用的藥物性肝損傷治療藥物，通過一定的抗氧化及免疫調節作用，達到促進肝細胞再生并保護肝細胞，增強肝臟解毒功能，減輕肝臟的病理損傷，減輕因四氯化碳及硫代乙酰胺引起的血清ALT 升高，改善肝功能的目的。因此本研究采用該藥物作為陽性對照。目前，甘草酸苷主要用于治療慢性肝病、改善肝功能異常[14]。有研究發現，甘草酸苷可以緩解雷公藤多苷所致的肝損傷[15]，其主要的機制包括減輕雷公藤多苷所致的細胞色素氧化酶CYP2B1的減少。本研究發現甘草酸苷對于對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷也有保護作用。組織學切片顯示，對乙酰氨基酚所致肝損傷主要體現在肝細胞的脂肪變性和淋巴細胞的浸潤。血清中升高的炎性反應指標，TNF-α 和IL-6 反映了對乙酰氨基酚導致的炎性反應水平的升高。免疫細胞浸潤及一系列免疫反應的激活是肝損傷的一個重要環節[16-17]。研究顯示，免疫浸潤和炎性反應與肝細胞的凋亡壞死常相互伴行[18]。使用甘草酸苷后，肝細胞的損傷及免疫浸潤水平明顯減輕。

對乙酰氨基酚的毒性代謝產物導致肝損傷的重要機制是其引起細胞及組織內過度的氧化應激反應[19]，其通過耗竭胞內的還原型物質GSH，導致氧化反應無法被抗衡，進而產生一系列應激反應、線粒體功能紊亂及細胞死亡[20]。NAC 正是具有強大的抗氧化作用，是目前緩解對乙酰氨基酚最有效的藥物。SOD 是細胞抗氧化體系的重要組成之一，而MDA是脂質過氧化的終產物，本研究結果顯示，甘草酸苷可有效緩解對乙酰氨基酚導致的GSH 及SOD 活性降低，有望取代NAC 成為緩解對乙酰氨基酚引起的肝內氧化應激水平的臨床藥物[21-23]。

綜上所述，甘草酸苷能夠減輕對乙酰氨基酚誘導的ALI，對其肝功能有保護作用，且還可減輕炎性反應、氧化應激和肝組織病理改變。本研究為臨床治療對乙酰氨基酚誘導的ALI 提供了一種新的藥物，但其是否具有其他作用機制、在臨床中應用的有效性及安全性等仍需要進一步探討，需作為后期的研究方向。