內源性抗氧化劑金屬硫蛋白對慢性間歇性乏氧引起的心肌損害的保護性作用及機制研究

王鶴儒 尹 霞 夏彬鳳 鄭慶霜 崔明月

（1.浙江大學醫學院附屬第一醫院心血管超聲中心，浙江 杭州，310000；2.吉林大學白求恩第一醫院心血管內科，吉林 長春，130000；3.吉林大學中日聯誼醫院老年病科，吉林 長春，130000）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是臨床常見的睡眠呼吸紊亂性疾病，心臟是其最常累及的主要臟器之一，OSA 已被認為是減少心血管疾病的公共健康干預的靶點之一[1]。OSA 所致的反復氧去飽和事件即慢性間歇性乏氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是其主要致病因素，而氧化應激（oxidstive stress，OS）是CIH 所致心臟損傷的主要發病機制之一[2-3]。

金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一種在心臟中高表達的內源性抗氧化蛋白，其表達可由人體必需微量元素鋅直接誘導[4]。除此之外，鋅離子可在氧化應激條件下通過促使穩定狀態的核因子E2 相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）水平上升來上調MT 的表達[5-6]。研究表明MT 表達上調對CIH 所導致的心臟損傷發揮保護性作用，而其作用機制鮮有闡明[7-10]。綜上，我們模擬CIH 環境建立心臟損傷模型，并對部分小鼠予以硫酸鋅及SFN 干預，通過檢測小鼠心臟結構及功能、心肌結構組織、相關蛋白因子的表達等指標，探究鋅及SFN 是否具有抗CIH 引起的心肌損傷的作用，并初步探索其作用機制，為臨床尋找更好的預防和治療OSA 及其相關心血管疾病的藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

昆明小鼠，8 周齡，雄性，體質量20～25 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，蘿卜硫素（B20805-20 mg，源葉生物，中國），硫酸鋅（S22124-500 g，源葉生物，中國），Nrf2 抗體（12721T，CST，美國），MT 抗體（ab235036，abcam，美 國），Akt1 抗 體（2938T，CST，美 國），Akt2 抗 體（5239S，CST，美國），天狼猩紅染液（Solarbio，中國）， 氧流控制系統及氧循箱（A84XOV，BioSpherix，美國），電泳儀（DYY-7C，北京，北京六一），酶標儀（ELX-800，美國，BIOTEK），超聲心動儀（Philips，SONOS 5500，中國）。本研究通過吉林大學白求恩第一醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 CIH 模型構建及SFN、硫酸鋅治療模型構建

選取體質量為20～25 g 的健康小鼠，隨機分為對照組、CIH 組、0.9%氯化鈉溶液組、CIH+硫酸鋅治療組、CIH+SFN治療組，每組5 只。CIH 組缺氧模式如下：20.9%及8%氧濃度每120 秒交換一次，暴露2 h/d，連續8 周。對照組小鼠：放置在室內空氣下相似的培養箱中。硫酸鋅及SFN 治療模型：在CIH 第二天分別給予硫酸鋅（5 mg/kg）及SFN（0.5 mg/kg）腹腔注射，隔天注射，持續給藥8 周。0.9%氯化鈉溶液組：在CIH 第二天給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.2.2 心臟功能評價

在實驗結束后，將所有小鼠予以戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）將其麻醉。采用Philips SONOS 5500 高效超聲系統監測心臟功能。取仰臥位固定小鼠，利用30 MHz 高頻探頭采集胸骨旁長軸切面，記錄M 型超聲心動圖像。

1.2.3 天狼猩紅染色

在小鼠被處死后，將部分心臟固定于10%福爾馬林中；經梯度酒精脫水、二甲苯透明及石蠟包埋后制作厚度為3 μm厚的石蠟切片，用天狼猩紅飽和苦味酸水溶液進行染色。使用光學顯微鏡進行觀察及拍照。

1.2.4 免疫組化

將制好的3 um 厚的石蠟切片進行脫蠟及水化，對抗原進行修復后用3%的氧化氫室溫孵育25 min，滴加10%山羊血清覆蓋組織，并置于室溫封閉30 min，將稀釋好的一抗滴入其中4℃過夜，復溫后滴入稀釋的二抗室溫孵育50 min，復染（蘇木素）后置入不同濃度的乙醇溶液中進行脫水，最后進行二甲苯透明及樹膠封片。

1.2.5 免疫印記（Western-blot）

提取各組小鼠的新鮮心肌組織總蛋白。根據蛋白定量的結果加入適量上樣緩沖液，稀釋配平后制成蛋白質樣品。取適量樣品上樣至SDS-PAGE 凝膠；使用恒壓電泳使蛋白質進入分離膠后加大電壓至120 V，預計目的蛋白分離后停止電泳；將SDS-PAGE 凝膠上蛋白質樣品電轉到硝酸纖維素膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別使用抗MT、Nrf2、Akt1、Akt2和內參β-actin 抗體4℃孵育過夜，TBST 洗滌10 min，重復3次；二抗室溫孵育1 h,TBST 洗滌10 min，重復3 次；滴加混好的ECL 發光液，室溫孵育3 min 后棄去，使用保鮮膜將條帶封存在暗夾后于暗室顯影。應用圖像處理分析軟件（Image J）對各組小鼠心肌的MT、Nrf2、Akt1、Akt2 和β-actin 條帶灰度值進行定量分析。

1.3 統計學分析

2 實驗結果

2.1 硫酸鋅及SFN 可改善CIH 導致的心臟結構及功能變化

超聲心動圖結果表明，在CIH 暴露8 周后，CIH+N.S 組與對照組相比，代表心臟結構的指標左心室內徑（left ventricle cavitary dimensions，LVID）明顯升高，代表心臟收縮功能的指標縮短分數（fractional shortening，FS）和射血分數（ejection fraction，EF）明顯降低，上述指標均差異有統計學意義（P<0.05）；硫酸鋅及SFN 干預后，兩組LVID 水平低于CIH+N.S 組，EF、FS 水平高于CIH+N.S 組，上述指標差異均有統計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2 CIH 導致小鼠心肌心肌纖維化

天狼猩紅染色將心肌中的膠原成分染成紅色，其余成分染成黃色。利用Image J 軟件測量心肌膠原纖維陽性區占所觀察視野的面積比，結果顯示：對照組小鼠心肌組織內大血管、小血管周圍及心肌質間可見少許膠原纖維沉積，CIH 組及CIH+N.S 組小鼠心肌組織內大小血管周圍可見明顯的膠原纖維沉積，SFN 及硫酸鋅干預組小鼠心肌內膠原組織沉積較CIH+N.S 組有所減少，見圖2。

2.3 硫酸鋅、SFN 上調MT、Nrf2、AKT2 的表達

WB 及免疫組化的結果表明，與對照組相比，CIH+N.S 組小鼠心肌組織中MT、Nrf2 及Akt2 在心肌中表達下降，差異有統計學意義（P<0.05）；與CIH+N.S 組相比，硫酸鋅及SFN干預組小鼠心臟組織中MT、Nrf2 及Akt2 的表達明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05），見圖3、圖4、圖5。

圖3 硫酸鋅及SFN 上調MT 表達

圖4 硫酸鋅及SF N 上Nrf2 表達

圖5 硫酸鋅及SFN 上Akt2 表達

3 討論

OSA 是一種睡眠呼吸障礙性疾病，其導致的反復氧去飽和事件即CIH 可對機體多個系統造成損害，在眾多并發癥中由CIH 導致的心肌損傷是OSA 最為常見的并發癥之一。CIH是一種長期、慢性、間歇性、夜間乏氧現象，心肌細胞在反復的缺氧/復氧環境中會產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）及 活 性氮（reactive nitrogen species，RNS），當超過機體的清除能力或機體的抗氧化能力下降不能將過量的ROS/RNS 清除時則會引起氧化和抗氧化失衡，由此導致氧化應激。未被清除的ROS/RNS 可導致心肌中脂質、DNA和蛋白質的損傷以及酶的失活，這將引起心肌細胞迅速的凋亡及壞死，最終導致心肌肥厚及心肌重塑。因此氧化應激（oxidstive stress，OS）是CIH 所致心臟損傷的主要發病機制之一。然而迄今為止，CIH 導致的心肌損傷的發病機制并未完全闡明，治療方法亦較少，因此明確其發病機制及新的藥物和治療方法具有十分重要的意義。

MT 是一種低分子量、內源性抗氧化蛋白，在人體內普遍存在，而在心臟相對高表達。MT 不僅可以直接清除自由基，還可以通過多條細胞信號轉導通路抑制氧化應激。大量研究表明，MT 可抵御多種病理狀態及物理因素如糖尿病、肥胖、缺血再灌注、膿毒血癥、吸煙、低溫等導致的心臟損傷，是一種強大而有效的內源性心臟保護蛋白[11-12]。然而尚無證據表明在CIH 條件下補鋅是否可誘導MT 表達并有效預防CIH 導致的心臟損傷。本研究發現補鋅能顯著改善CIH 所導致的心臟結構改變及心功能低下，減少膠原纖維在心肌中沉積，明顯減輕了心肌纖維化程度。而在8 周時，與對照組相比，CIH組及CIH+N.S 組MT 的表達出現明顯下降，而在硫酸鋅與SFN 干預后MT 的表達明顯升高，因此我們認為，鋅及SFN對CIH 導致的心臟損傷發揮保護性作用可能依賴于上調MT表達實現。

研究表明MT 可由多種物質通過多條途徑誘導表達[4]。其中人體必需微量元素鋅被認為是內源性MT 的誘導劑之一，可有效誘導其在體內的表達[13]。首先，MT 由鋅直接誘導表達的經典方式為鋅離子經ZIP 轉運進入細胞后激活金屬反應元件轉錄因子1（metal regulatory transcription factor 1，MTF-1），隨后MTF-1 易位進入細胞核,與MT 基因的啟動子區域結合,上調MT 基因轉錄使其表達增加[14-15]。除此之外，鋅離子可作為第二信使，將細胞的內源性“危險信號”傳遞給Nrf2 負調控因子Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白（Kelch-1ike ECH- associated protein l，Keap1），而鋅離子與Keap1 接觸后會導致其構象改變，從而抑制Nrf2 的泛素化，細胞內Nrf2 水平上調使穩定狀態的Nrf2 水平上升進而上調MT 等一系列抗氧化蛋白的表達[5-6]。因此，本研究在檢測MT 蛋白水平的基礎上還進一步檢測了各組小鼠心肌組織中Nrf2 的表達情況。結果表明，硫酸鋅及SFN 干預組Nrf2 水平亦上調。首先對于SFN 來說，其作為Nrf2 的激活劑可直接使穩定狀態的Nrf2 水平上調，從而增加其下游抗氧化蛋白MT 的表達；而對于鋅來說，結合實驗結果我們認為其有可能通過直接及間接兩種方式影響MT 的表達。

另有實驗證明MT 減輕CIH 所致心肌細胞凋亡、炎性反應、心臟結構改變及心功能下降等是通過激活Akt 信號通路實現[16]；而MT 可通過PI3K/Akt 通路與Nrf2 協同對CIH 導致的心臟損傷發揮保護性作用[9-10]。因此我們認為MT 的心臟保護作用的發揮與Akt 信號通路密切相關，然而Akt 有三種亞型，每個亞型對于心臟的作用不盡相同。CIH 條件下到底是哪一類型的Akt 發揮主要作用尚不明確，因為Akt1 和Akt2 均在心臟中具有相對高表達，Akt3 僅在心臟中的低水平表達，且其主要功能與大腦的生長及功能密切相關，于是我們檢測了小鼠心肌中的總Akt1 和Akt2 的蛋白水平[17]。實驗結果表明，在SFN 及硫酸鋅治療組中Akt2 的表達均明顯上調。由此可見，Akt2 可能在MT 減輕CIH 導致的心臟損傷的過程中發揮了主要作用。

綜上所述，本研究發現MT 在CIH 導致的心肌損傷中發揮了保護性作用，補鋅可能會直接及間接地誘導MT 的表達，SFN 作為Nrf2 的激活劑可能間接上調MT 的表達，而Akt 信號通路可能參與了MT 的保護性作用。本研究為CIH 導致的心肌損傷的發病機制提供了理論依據，為OSA 導致的心臟相關并發癥的臨床治療提供了一種潛在的候選藥物。