基于RAPD分子標記的觀賞春石斛遺傳多樣性分析

劉貝寧 李劉敏 陳發興

摘要要：【目的】利用RAPD分子標記對觀賞春石斛的遺傳多樣性進行分析。【方法】以10份觀賞春石斛種質資源為供試材料，采用100條RAPD隨機引物進行篩選。【結果】從篩選出來的15條具有良好多態性的引物中擴增得到125個DNA條帶，其中80個條帶表現出多態性，多態性位點比率為63.89%。聚類分析結果顯示，在相似系數為0.37時10份樣本分為兩大類，在相似系數0.41時可進一步分為兩個亞類群。【結論】利用RAPD分子標記可以鑒別觀賞春石斛種質資源。

關鍵詞：春石斛；種質資源；RAPD標記；多態性

中圖分類號：S682.31 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2095-5774（2023）04-0257-08

Genetic Diversity Analysis of Ornamental Spring Dendrobium Based

on RAPD Molecular Markers

Liu Beining1， Li Liumin2， Chen Faxing2*

（1 International College，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China;

2 College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China）

Abstract：【Objective】 The genetic diversity of Dendrobium was analyzed using RAPD molecular markers. 【Method】 Using 10 ornamental spring Dendrobium germplasm resources as test materials， 100 RAPD random primers were used for screening. 【Result】125 DNA bands were amplified from 15 primers with good polymorphism， of which 80 bands showed polymorphism， and the ratio of polymorphic sites was 63.89%. The results of cluster analysis showed that 10 samples can be divided into two groups when the similarity is 0.37， and further divided into two groups when the similarity coefficient is 0.41. This study can provide theoretical basis for the breeding of ornamental Dendrobium. 【Conclusion】 RAPD molecular markers can accurately identify ornamental spring Dendrobium germplasm resources.

Key Words：Spring Dendrobium；Germplasm resources；RAPD marker；Polymorphism

石斛屬（Dendrobium）為蘭科（Orchidaceae）第二大屬植物，全球范圍內有1400余種［1］。中國石斛屬植物有100余種［2］，其中13種為我國特有種，包括鐵皮石斛（Dendrobium officinale）和霍山石斛（Dendrobium huoshanense）［3］。石斛屬植物包括藥用石斛和觀賞石斛，藥用石斛在我國應用歷史悠久，最早記載于東漢時期的《神農本草經》，其在糖尿病、心血管疾病、腫瘤、神經系統疾病等疾病的治療上應用潛力巨大［4］；觀賞石斛有著豐富獨特的花型、花色及圖案，以及別具一格的花香，受到消費者的青睞。近些年來，石斛產業的發展主要依賴于野生石斛種質資源，石斛新品種的選育較少，且多集中在藥用石斛 ［5］。觀賞春石斛多作為盆栽供室內觀賞，在春節前作為年宵花上市，因其形態雍容華貴，具有高雅尊貴的氣質，被人們稱為“成功之花”。

分子標記在植物學研究中廣泛應用于品種鑒定、遺傳關系鑒定、遺傳多樣性檢測、遺傳圖譜構建等領域［6］。當前已有許多模式植物完成全基因組測序，為分子標記技術的發展奠定基礎［7］。目前石斛屬的分子標記研究集中在原生種、秋石斛栽培種及藥用價值較高的石斛，而尚未見到觀賞春石斛相關的研究報道。本研究通過RAPD分子標記技術對10份供試觀賞春石斛進行聚類分析，以期進一步評價觀賞春石斛種間的遺傳多樣性，為觀賞春石斛種質資源的準確鑒別提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為10份觀賞春石斛種質（表1、圖1），由泉州市泉豐生物科技有限公司提供。

參照《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 石斛屬》［8］，對供試觀賞春石斛表觀性狀進行觀測描述，結果見表2。

1.2 試驗方法

1.2.1 觀賞春石斛葉片DNA提取

選取觀賞春石斛新鮮葉片，采用翌圣生物科技（上海）股份有限公司植物DNA試劑盒提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA的提取質量進行觀察，檢測基因組條帶有無及完整性。使用超微量紫外分光光度計測定其濃度、OD260/OD280值，選取OD260/OD280值在1.8～2.0的樣品進行后續RAPD-PCR擴增。

1.2.2 觀賞春石斛PCR體系優化

根據預實驗確定PCR體系為15 μL的體系，其中：模板DNA 3 μL，RAPD引物3 μL，PCRmix酶7 μL，ddH2O 2 μL。選擇模板DNA濃度、引物濃度、退火溫度3個條件進行單因素梯度優化，各因素水平如表3。

PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸3 min，進行40個循環；72℃延伸6 min。采用1×TAE配制1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增的產物進行檢測，電泳條件為120 V，90 mA，25 min左右，時間根據溴酚藍指示劑的位置進行控制。

1.3 觀賞春石斛遺傳多樣性分析

本研究使用的RAPD 隨機引物 100 條由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。對RAPD-PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將清晰可重復的條帶記為“1”，將同一位置上的弱帶、不重復或沒有出現的條帶記為“0”。建立“1”、“0”數據矩陣，統計擴增出的總條帶數和多態性條帶數，計算各個引物的多態性比率。采用Ntsys 2.10e進行聚類分析［8］。

2 ?結果與分析

2.1 觀賞春石斛基因組DNA提取與分析

所有DNA電泳結果如圖2所示。電泳結果顯示，DNA條帶明亮、無雜帶和彌散情況，表明得到的DNA完整，沒有或較少降解，可在后續用作RAPD標記的模板。

超微量紫外分光光度計測定10份觀賞春石斛的DNA濃度及質量結果見表4，由于不同品種石斛之間多糖含量的差異，所提取的石斛基因組DNA濃度差距較大，在42.032～170.406 ng/μL不等，多集中在60～100 ng/μL。OD260 /OD280均在1.8～2.0，進一步表明提取得到的基因組DNA沒有或較少降解，純度較高，可用作RAPD標記的模板。

2.2 觀賞春石斛RAPD-PCR體系優化

RAPD-PCR體系中模板DNA濃度優化結果見圖3，當DNA濃度為12 ng/μL時，條帶相對更加明亮、清晰，數量最多，效果最好。

對引物濃度的優化結果見圖4，引物濃度為9 μmol/L時擴增得到的條帶數最多、效果最清晰。因此，RAPD-PCR體系的引物濃度選用9 μmol/L。

對退火溫度進行優化結果見圖5，退火為38.3℃時擴增得到的條帶數最多、條帶最為清晰明亮。因此，RAPD-PCR體系的退火溫度選用38.3℃。

綜上分析，觀賞春石斛RAPD的最佳反應體系為15 μL的體系包括：9 μmol/L的引物3 μL，

12 ng/μL的模板DNA 3 μL，PCRmix酶7 μL，ddH2O 2 μL。

2.3 觀賞春石斛引物多態性分析

先選取表觀差異較大的‘潑墨皇后和‘黃金巴比倫對100條隨機引物進行篩選，得到20條在這兩種石斛中均能擴增得到三條及以上條帶數的引物（圖6）。進一步篩選得到15個具有良好多態性的引物，從篩選出來的15個具有良好多態性的引物中擴增得到125條DNA條帶，每個引物擴增所得的條帶數量在6到11之間（見表5）。其中，80條DNA條帶表現出多態性，多態性位點比率為63.89%。

2.4 觀賞春石斛聚類分析

根據10份觀賞春石斛的形態學特征對其進行分類。其中，除‘甜蜜之月和‘紅火鳥外其他石斛唇瓣均有眼結構；‘拿坡里、潑墨皇后、‘中華夢和‘櫻花美人的萼片及花瓣圖案模式均為鑲邊；潑墨皇后和中華夢之間的性狀相似程度最高；黃金巴比倫與紅火鳥的花均較小，且花瓣為窄橢圓形，唇瓣圖案模式均有網狀，與其他8份種質均差別明顯。

使用NTsys 2.10e對0，1矩陣進行分析，利用非加權平均法（UPGMA）得到10份觀賞春石斛的聚類分析圖（圖7），在相似性系數為0.37時可以將10份種質分為兩大類：第Ⅰ類包括黃金巴比倫和紅火鳥，這兩份種質花直徑均較小，花瓣形狀相同，唇瓣圖案均具有網狀模式，其余石斛種質中沒有相同花瓣形狀及唇瓣圖案；此兩份種質的表觀性狀相似程度高，且與其他8份石斛種質有著明顯區別，唇瓣圖案具有網狀模式，花直徑也較小，也是兩者獨有的表觀性狀特征。

第Ⅱ類在相似性系數為0.41時又可分為兩個亞類群（第Ⅰ亞類和第Ⅱ亞類），第Ⅰ亞類包括‘變異國王、櫻花美人、‘紅星，第Ⅱ亞類包括拿坡里、甜蜜之月、潑墨皇后、中華夢和‘紅小町。潑墨皇后與中華夢相似度最高，這兩份石斛屬于觀賞春石斛中的潑墨石斛，其花朵的顏色類型和顏色數量十分相似、花瓣與萼片圖案模式、唇瓣眼類型與唇瓣圖案模式均存在高度相似。變異國王和紅星在表觀性狀上也有著部分相似，唇瓣眼類型及圖案模式相同，且與其余供試石斛種質差別明顯。因此，RAPD標記顯示供試觀賞春石斛種質資源間具有豐富的遺傳多樣性，且可以使用RAPD分子標記對觀賞春石斛進行初步分類。

3 ?討論與小結

張楊等［9］采用RAPD分子標記技術，對金釵石斛、鐵皮石斛和齒瓣石斛等三種石斛進行研究，從分子水平揭示這三種石斛屬植物的遺傳背景。朱勝男等［10］采用RAPD技術對31種石斛屬植物的遺傳多樣性進行分析，證明RAPD標記技術可以用于石斛屬植物的物種鑒定和遺傳多樣性研究。

本研究10份供試石斛種質均屬于觀賞春石斛，經過多代雜交獲得，親緣關系較為復雜。崔學強等［11］通過SNP標記的開發將60份供試石斛種質資源分成三個類群，包括本試驗的9份種質，其中中華夢和潑墨皇后等2份種質被分入Ⅱ類群，拿坡里、變異國王、紅小町、櫻花美人、紅星、黃金巴比倫和紅火鳥等7份種質被分為Ⅲ類群。本研究結果表明中華夢和潑墨皇后品種間相似系數最高、親緣關系較近，兩者在表觀性狀上也有著高度相似。黃金巴比倫和紅火鳥單獨分為一類，這與崔學強等［11］的研究結果相符，且黃金巴比倫和紅火鳥的花型、花瓣、唇瓣、萼片形狀相似，同時與本研究中其他8份種質均有較大差距，黃金巴比倫和紅火鳥的唇瓣圖案模式具有網狀，也是其他8份觀賞春石斛不具備的特征。

參考文獻：

［1］Pridgeon A M， Cribb P J， Chase M W. Genera Orchidacearum volume 6： Epideudroideae （part 3）［M］. Oxford University Press， 2014：1180-1183

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［8］中華人民共和國農業部. NY/T 2758-2015 植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 石斛屬［S］. 北京： 中國標準出版社， 2015.

［9］張楊， 陳志寬， 賴育菠， 等. 應用RAPD分子標記技術探討3種石斛屬植物的種間關系［J］. 亞熱帶植物科學， 2014， 43 （2）： 123-126.

［10］朱勝男， 周振華， 馮尚國， 等. 31種石斛屬植物的RAPD遺傳多樣性分析［J］. 杭州師范大學學報（自然科學版）， 2011， 10 （4）： 333-339.

［11］崔學強， 黃昌艷， 鄧杰玲， 等. 基于SLAF-seq技術的石斛蘭SNP標記開發及親緣關系分析［J］. 生物技術通報，2023， 39 （6）： 141-148.

（責任編輯：鐘海豐）