外源激素處理提高小尾寒羊和蒙古羊春季繁殖力的研究

鄧宇，趙瑞霞，李寶棟*，劉樹才，榮迪，阿拉坦莎，李巍巍，趙禹凱

(1.赤峰市農牧科學研究所畜牧研究室，內蒙古 赤峰 024000；2.巴林右旗農牧業局農牧技術推廣中心，內蒙古 赤峰 025150)

赤峰市巴林右旗地處內蒙古自治區中東部，為典型的農牧交錯帶肉羊養殖優勢區域[1]，養殖的綿羊既有常年發情、多胎的小尾寒羊，也有季節性發情、單胎的蒙古羊[2]。2013年以來孕激素陰道海綿栓+孕馬血清促性腺激素(PMSG)的綿羊同期發情處理方法雖然在本地區得到應用，但春季受胎率仍下降明顯，不能滿足生產需要。

近年來有關提高綿羊同期發情與人工授精效果的研究報道較多，田樹軍等[3]、辛曉玲等[4]都采用撤栓前注射PMSG，可顯著提高母羊的同期發情率和發情集中度。有多項研究表明，在母羊首次輸精時注射促黃體素釋放激素A3(LHRH-A3)可進一步促進排卵[5-7]。吳奇強等[8]和勞劍[9]在豬和牛精液中添加催產素(OXT)，提高了母豬配種分娩率、窩均產活仔數、窩均總產仔數和母牛受胎率。

本試驗以春季的小尾寒羊、蒙古羊為對象，分析不同外源激素處理對兩個品種綿羊繁殖指標、血液生殖激素濃度的影響，為改進綿羊春季同期發情與人工授精的應用效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗所用小尾寒羊母羊為巴林右旗查干諾爾蘇木規模化養殖戶飼養，采用定時飼喂、自由飲水、欄內散放；蒙古羊母羊為巴林右旗幸福之路蘇木規模化養殖戶飼養，采用放牧加補飼，歸牧時飲水。

2022年3—4月，選擇空懷、斷奶1 個月以上、體重45～55 kg、胎次為2～4胎的小尾寒羊母羊和蒙古羊母羊各120只，小尾寒羊、蒙古羊按不同外源激素處理分別隨機均分為4組，每組3個重復，每個重復10只，分組情況詳見表1。

表1 各試驗組同期發情與人工授精方法

1.2 主要試劑

孕激素陰道海綿栓，氟孕酮(FGA)含量為45 mg/枚，由澳大利亞法佩斯制藥廠生產；注射用PMSG(1 000 U/支)，注射用LHRH-A3(25 μg/支)，OXT注射液(20 U/支)，均由寧波第二激素廠生產。

綿羊雌激素(E2)、孕激素(P4)、促黃體素生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)的ELISA檢測試劑盒均由上海優選生物科技有限公司生產，采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗進行檢測。

1.3 同期發情與人工授精

根據前期研究實踐，春季存在試情公羊不能檢出所有發情母羊的情況，為了不遺漏隱性發情母羊，所以對所有試驗母羊都進行了人工授精。各組同期發情與人工授精方法見表1。

1.4 血液生殖激素濃度測定

小尾寒羊、蒙古羊每個重復組挑選5只母羊，根據前期研究實踐，分別于放栓當天(第0天)上午(對試驗母羊進行同期發情激素處理前)，第13天下午(試驗母羊集中表現發情時)和第14天下午(試驗母羊集中排卵受孕時)，使用抗凝采血管頸靜脈采血10 mL，3 000 r/min離心30 min制備血漿后于-20 ℃保存。根據撤栓后48 h試情時母羊發情的情況，每個重復組挑選3只表現發情的母羊血漿，測定血漿中E2、P4、LH、FSH和GnRH濃度。

1.5 B超孕檢

第3次人工授精后第37天，母羊站立保定，使用B超儀的線陣探頭進行直腸孕檢，統計懷孕母羊數。

1.6 繁殖指標及其計算公式

發情反應率=發情母羊數/試驗母羊數×100%；同期受胎率=懷孕母羊數/輸精母羊數×100%，母羊是否懷孕以B超孕檢結果為準；同期妊娠率=妊娠母羊數/試驗母羊數×100%，母羊受孕并產羔作為認定妊娠的依據；產羔率=羔羊數/產羔母羊數×100%。

1.7 數據處理和分析

試驗數據經Excel 2016初步整理后，使用SPSS 20.0中單因素ANOVA的Duncan法進行方差分析。試驗結果用“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 母羊繁殖指標對比

由表2可知，對比發情反應率，蒙古羊試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于對照組(P<0.01)。對比同期受胎率，蒙古羊試驗Ⅱ組極顯著高于其他3組(P<0.01)。對比同期妊娠率，小尾寒羊試驗Ⅲ組極顯著高于對照組、試驗I組(P<0.01)并顯著高于試驗Ⅱ組(P<0.05)；蒙古羊試驗Ⅱ組極顯著高于對照組、試驗Ⅲ組(P<0.01)并顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)。對比產羔率，小尾寒羊試驗Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于對照組、試驗Ⅰ組(P<0.01)。

表2 不同試驗組母羊繁殖指標對比 %

2.2 母羊血漿E2濃度對比

由表3血漿E2濃度檢測結果可知，放栓第13天，小尾寒羊試驗Ⅱ組顯著低于對照組(P<0.05)，試驗Ⅲ組極顯著高于其他3組(P<0.01)；放栓第14天，小尾寒羊試驗Ⅲ組顯著高于試驗Ⅱ組(P<0.05)。蒙古羊在放栓后13 d和14 d，各組之間血漿E2濃度均無顯著差異。

表3 不同試驗組母羊血漿E2和P4濃度對比 pg/mL

2.3 母羊血漿P4濃度對比

由表3血漿P4濃度檢測結果可知，放栓第14天，小尾寒羊試驗Ⅱ、Ⅲ組顯著高于對照組(P<0.05)；蒙古羊試驗Ⅰ組顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 母羊血漿LH濃度對比

由表4血漿LH濃度檢測結果可知，放栓第13天，蒙古羊試驗Ⅰ組顯著低于對照組(P<0.05)，試驗Ⅱ、Ⅲ組極顯著低于對照組(P<0.01)；放栓第14天，蒙古羊試驗Ⅲ組顯著高于對照組(P<0.05)。小尾寒羊在放栓后13 d和14 d，各組之間血漿LH濃度均無顯著差異。

表4 不同試驗組母羊血漿LH和FSH濃度對比 mU/mL

2.5 母羊血漿FSH濃度對比

由表4血漿FSH濃度檢測結果可知，放栓第13天，蒙古羊試驗Ⅰ組極顯著高于對照組、試驗Ⅲ組(P<0.01)，試驗Ⅱ組顯著高于對照組、試驗Ⅲ組(P<0.05)。放栓第14天，小尾寒羊試驗Ⅰ組極顯著高于其他3組(P<0.01)；蒙古羊試驗Ⅰ、Ⅲ組極顯著高于對照組(P<0.01)，試驗Ⅱ組極顯著高于其他3組(P<0.01)。

2.6 母羊血漿GnRH濃度對比

由表5血漿GnRH濃度檢測結果可知，放栓第13天，小尾寒羊試驗Ⅰ組顯著高于對照組、試驗Ⅲ組(P<0.05)，極顯著高于試驗Ⅱ組(P<0.01)；蒙古羊試驗Ⅰ、Ⅱ組極顯著低于對照組、試驗Ⅲ組(P<0.01)，試驗Ⅰ組顯著高于試驗Ⅱ組(P<0.05)。放栓第14天，小尾寒羊試驗Ⅰ、Ⅱ組顯著高于對照組(P<0.05)，試驗Ⅲ組極顯著高于對照組(P<0.01)；蒙古羊試驗Ⅰ組顯著低于對照組(P<0.05)，極顯著低于試驗Ⅱ、Ⅲ組(P<0.01)，試驗Ⅱ組顯著高于對照組(P<0.05)。

表5 不同試驗組母羊血漿GnRH濃度對比 mU/mL

3 討論

3.1 撤栓前24 h注射PMSG對母羊繁殖性能的影響

綿羊同期發情與人工授精的處理方法通常是將孕激素陰道海綿栓與PMSG結合使用，馮建忠[10]指出，孕激素栓劑可抑制卵泡生長發育，放置一定時間撤除后，由于失去外源P4控制且周期性黃體已退化，母羊將同時出現卵泡發育進而集中發情。然而該方法也存在一定缺陷，Haresign[11]報道，撤栓后母羊血漿P4濃度的下降極顯著快于黃體自然溶解時，LH濃度會快速升高到排卵時的峰值，從而可能引起精子運輸障礙和E2分泌異常。

田樹軍等[3]、辛曉玲等[4]研究表明，撤栓前注射PMSG可顯著提高母羊的同期發情率和發情集中度。根據上述研究，為了在P4緩慢下降時更好地發揮PMSG對母羊發情受孕的促進作用，本研究中試驗Ⅰ組即采用撤栓前24 h注射PMSG。

張英杰等[12]認為，小尾寒羊在4—6月和9—11月的FSH、LH分泌量更高，此時小尾寒羊發情也最為旺盛。賀建寧等[13]研究指出，小尾寒羊外周血液中E2、P4、FSH、LH在四季變化基本穩定，但具體分泌量春季仍較低。孫曉萍等[14]報道，GnRH由下丘腦神經纖維分泌，其引起垂體前葉分泌FSH和LH，FSH和LH通過血液與卵巢上特定的受體結合，促進卵泡的生長發育、成熟和排卵。熊柱[15]報道，對切除垂體的動物在高濃度FSH制劑下能促使卵泡生長，但不能使其排卵；而單獨給予LH制劑時對卵巢也無明顯作用，除非FSH提前刺激卵巢，LH才有可能促使成熟的卵泡排卵。本研究中，提前注射PMSG后，小尾寒羊血漿E2濃度先降低后升高但不顯著，P4、LH濃度升高但不顯著，FSH濃度極顯著升高，GnRH濃度顯著升高。結合前人研究推測，提前注射PMSG對于小尾寒羊P4、LH、FSH、GnRH的分泌有促進作用，可使小尾寒羊生殖激素分泌更加符合發情旺盛期的狀態；盡管FSH、GnRH濃度升高明顯，但由于缺少較高濃度P4、LH的協同作用而未能有效提高母羊繁殖力相關的4項指標。

常璐等[16]報道，卵子發育對發情時的E2高濃度水平有積極的反饋作用，而E2濃度的下降對配種后促進胚胎著床和維持正常妊娠活動有重要作用。賀建寧等[13]研究發現，P4控制FSH分泌峰的周期性，可使卵巢由靜止變為活躍，恢復母羊正常的發情和排卵。田占偉等[17]研究指出，自然發情的哈薩克綿羊，發情期時母羊的P4分泌量顯著大于乏情期。Soriano等[18]認為，季節性發情的綿羊品種，其LH的分泌存在著季節性變化，在繁殖季節升高，在非繁殖季節降低。本研究中，蒙古羊提前注射PMSG后，血漿E2濃度先上升后下降，放栓第14天血漿P4濃度顯著升高，LH濃度升高但差異不顯著，FSH濃度極顯著升高，但GnRH濃度顯著下降。綜合前人研究推測，與小尾寒羊相比，春季提前注射PMSG也使蒙古羊血液中P4、LH、FSH的分泌更有利于發情受孕；蒙古羊E2濃度變化更加符合卵泡發育需要且P4濃度顯著升高，從而促進了發情反應率極顯著提高，由于血液GnRH濃度顯著降低對繁殖調控造成不利影響，沒能顯著提高其他3項繁殖指標。

綜上，提前注射PMSG有利于綿羊生殖激素的分泌，但對P4濃度的減緩下降和對繁殖的促進作用，小尾寒羊弱于蒙古羊。

3.2 注射LHRH-A3對母羊繁殖性能的影響

LHRH-A3是人工合成的多肽激素，為下丘腦分泌的促黃體素釋放激素(LH-RH)的類似物，馮建忠[10]指出，生理劑量的LH-RH主要引起LH和FSH的合成與釋放，但以對LH的刺激作用為主。魏立明等[6]秋季對湖羊和小尾寒羊采用孕激素硅膠栓(CIDR)+PMSG進行同期發情并在首次人工授精時肌肉注射LHRH-A312.5 μg/只，取得了較好的效果。趙冰茹等[7]秋季對薩福克供體母羊超數排卵時，在母羊發情后14 h進行腹腔鏡輸精的同時注射LHRH-A325 μg/只，可進一步促進排卵。基于上述研究成果，為了進了一步提高血液中促性腺素的濃度，本研究中試驗Ⅱ組在提前注射PMSG的基礎上，首次輸精時肌肉注射LHRH-A312.5 μg/只。

秋季仍是小尾寒羊的發情旺盛期，賀建寧等[13]研究得出，小尾寒羊、灘羊血液中LH濃度秋季顯著高于春季；Suttie等[19]研究發現，秋季短日照可以促進P4分泌，而春季長日照則具有明顯的抑制作用。陳欣[20]認為，LH濃度存在“閾值”和“上限”，在卵泡發育后期，隨著血漿FSH濃度的下降，排卵前卵泡發育對LH產生依賴，當LH的濃度高于閾值并低于上限值時，才能起到正常的調節作用。本研究表明，與試驗Ⅰ組相比，放栓第14天，小尾寒羊試驗Ⅱ組血漿E2和GnRH濃度降低但差異不顯著，P4和LH濃度繼續升高但差異不顯著，FSH濃度極顯著降低。結合前人研究推測，提前注射PMSG并肌注LHRH-A3，可使小尾寒羊LH、P4的分泌更符合繁殖旺盛期的狀態；LH濃度的增加雖仍差異不顯著，但可能高于調控閾值，已經能使更多的成熟卵泡排卵，進而使母羊產羔率極顯著提高；肌注LHRH-A3可能使垂體減少了GnRH的分泌，雖然LH濃度仍得到提高，但導致了FSH濃度的降低，這使得母羊卵泡的發育成熟受限，同期妊娠率因此有所提高但不顯著。

蒙古羊是內蒙古特有的季節性發情綿羊品種，趙興緒[21]認為，綿羊季節性繁殖可能是由于E2負反饋抑制了GnRH的脈沖式釋放，從而使LH的波動式分泌頻率降低，最終導致母羊排卵前的生理變化終止。Karsch等[22]報道，春季長日照使E2對其他生殖激素的負反饋調節加強，從而抑制了雌性動物的發情和排卵；秋季短日照時E2正反饋調節加強，變為促進發情排卵。本研究中，與試驗Ⅰ組相比，放栓第14天，蒙古羊試驗Ⅱ組血漿E2、P4濃度降低但不顯著，LH濃度繼續升高但差異不顯著，FSH、GnRH濃度極顯著升高。結合上述研究推測，提前注射PMSG并肌注LHRH-A3后，蒙古羊血液E2濃度進一步降低，這可能有利于減弱E2對其他生殖激素的負反饋作用；與小尾寒羊不同，蒙古羊肌注LHRH-A3使GnRH濃度明顯升高，增強了對FSH、LH分泌的促進作用，可使更多的母羊排卵受孕，從而同期受胎率極顯著提高、同期妊娠率顯著提高。但可能由于LH濃度仍明顯低于小尾寒羊，所以未能提高產羔率。

綜上，提前注射PMSG并肌注LHRH-A3，可增加小尾寒羊LH分泌從而促進胎產多羔，可減弱蒙古羊E2負反饋作用、提高GnRH分泌，進而提高繁殖指標。

3.3 稀釋精液中添加OXT對母羊繁殖性能的影響

OXT是一種主要由下丘腦神經垂體分泌的肽類激素。張效生等[23]認為，精液中添加OXT和LHRH-A3可進一步提高精子、卵子在生殖道里的運行和卵子的受精力，進而提高配種受胎率。張居農等[24]進行的大規模非繁殖季節誘導母羊發情研究中，采用母羊輸精同時將LHRH-A2加入精液并對精液進行了OXT處理，他們認為該措施的原理是通過激素的局部吸收，有利于配子的運行和受精，從而可達到較好的受胎率。吳奇強等[8]對豬的研究表明，OXT具有促進輸卵管和子宮平滑肌收縮的作用，能刺激母豬排卵，提高精液的吸收量和運行速度，延緩和減少精液倒流。基于上述研究，為了增強人工授精后精卵間的結合，本研究中試驗Ⅲ組采用在提前注射PMSG、肌注LHRH-A3基礎上，對稀釋后的精液按照1 U/mL添加OXT。

趙海全等[25]報道，OXT具有促進子宮收縮(催產)、乳腺排乳、卵泡發育及排卵、黃體形成和溶解、調節發情周期等重要作用，并參與神經內分泌系統的調節，如下丘腦-垂體-性腺軸，下丘腦-垂體-腎上腺軸。Copland等[26]報道，OXT是一種促進成熟卵泡變為黃體的因子，對不同階段顆粒細胞的分化有作用，可影響其對P4合成的增加和減少。本研究中，與試驗Ⅱ組相比，放栓第14天，小尾寒羊試驗Ⅲ組血漿E2濃度顯著升高，P4、LH、GnRH濃度升高但差異不顯著，FSH濃度降低但差異不顯著。結合前人研究分析，提前注射PMSG、肌注LHRH-A3并對稀釋精液添加OXT，的確可使小尾寒羊同期受胎率、同期妊娠率有不同程度的提高，這可能不僅與子宮收縮和配子運行增強有關，也與其對E2、P4、LH和GnRH分泌的促進作用有關。

OXT對腺垂體激素分泌的調節可能除了由門靜脈血管到達腺垂體起作用，還可通過神經直接對腺垂體進行調節，其可促進GnRH誘導LH的生成[27]。本研究中，與試驗Ⅱ組相比，放栓第14天，蒙古羊試驗Ⅲ組血漿E2、GnRH濃度降低但差異不顯著，P4、LH濃度升高但差異不顯著，FSH濃度極顯著降低。結合已有研究分析，與小尾寒羊不同，提前注射PMSG、肌注LHRH-A3并對稀釋精液添加OXT，蒙古羊同期受胎率、同期妊娠率極顯著降低，這可能是因為OXT限制了GnRH的分泌與調節作用，具體的作用機理相關報道較少，需要開展進一步的針對性研究。

綜上，提前注射PMSG、肌注LHRH-A3并對稀釋精液添加OXT，提高了小尾寒羊的懷孕比率但卻使蒙古羊的懷孕比率降低，這可能是FSH、GnRH分泌水平不同造成的。

4 結論

撤栓前24 h注射PMSG，可有效提高蒙古羊發情率；撤栓前24 h注射PMSG+LHRH-A3，可有效提高小尾寒羊產羔率、蒙古羊同期受胎率及同期妊娠率；撤栓前24 h注射PMSG+LHRH-A3+稀釋精液中添加OXT，可有效提高小尾寒羊同期妊娠率。

提前注射PMSG可促進母羊生殖激素分泌，LHRH-A3、OXT對小尾寒羊、蒙古羊GnRH、FSH的分泌影響不同。