豬流行性腹瀉病毒解旋酶Nsp13表達純化及其RNA解旋活性鑒定

沈熹涓，姬晶晶，金慧琴，李宇哲，劉斐，單衍可

(南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、高流行性、高死亡率傳染病，患病豬的主要癥狀為腹瀉、嘔吐和脫水，任何年齡段豬均可感染[1]，其中1周齡以內仔豬受影響最大，其癥狀最為嚴重，病死率最高[2]。PED于1971年在英國首次發現，并在1982年被正式命名，多個國家及我國南方省份均有PED大規模暴發的記錄，給國內外的養豬業帶來了巨大損失和打擊[3-4]。

PEDV是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬冠狀病毒科α冠狀病毒屬[5]，基因組全長約為28 kb，編碼2個開放閱讀框(ORF)1a和1b，能夠分別被翻譯成多聚蛋白1a (pp1a)和多聚蛋白1ab (pp1ab)，并被病毒蛋白酶加工成16個非結構蛋白，共同參與基因組的轉錄[6-7]。其中，PEDV Nsp13是一種屬于1超家族(SF1)的解旋酶，高度保守，能夠以NTP依賴的方式以及5′→3′的極性解開雙鏈DNA或RNA，是重要的抗病毒藥物設計潛在靶點[8]。

病毒的RNA解旋酶在其他病毒的研究中已被廣泛證實能夠在RNA合成過程中起到關鍵作用，能夠參與病毒的復制，還能夠刺激宿主細胞產生抗病毒效應[9-11]，但PEDV Nsp13是否存在以上特點尚待研究。Ren等[8]研究證實了PEDV Nsp13的5′→3′雙鏈DNA和RNA解旋極性，且在體外對雙鏈DNA的解旋能力高于雙鏈RNA。然而迄今為止，針對PEDV Nsp13的可溶性表達純化及其RNA解旋活性的研究仍然較少。

本文利用大腸桿菌系統對PEDV Nsp13進行可溶性表達，并利用鎳親和層析技術對該蛋白進行純化及其條件優化，得到了0.9 mg/mL PEDV Nsp13蛋白，驗證了其具有RNA解旋活性，并比較了相同時間內不同溫度條件下的解旋效果，為進一步深入研究PEDV Nsp13的RNA解旋作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質粒與菌種

參考GenBank提供的PEDV (JX188454.1)中Nsp13基因序列，委托通用生物(安徽)股份有限公司進行密碼子優化、合成及構建。pET28a(+)載體由本實驗室保存。Trans5α與Transetta (DE3)感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 RNA單鏈

參考Ren等[8]與Shu等[12]對RNA底物的設計，并對RNA鏈中存在的能夠造成自身互補序列及二硫鍵序列進行調整。RNA1序列：5′-(Cy5)CAUAC-AGUACAGGGAUCACCUCAGUUCGACUAUCGAGUAAUC-3′，RNA2序列：5′-GAUUACUCGAUAGUCGAA-CUGAGG-3′，trap RNA序列：5′-CCUCAGUUCGACUAUCGAGUAAUC-3′。上述序列均由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要試劑

蛋白Marker (180 kDa)與ECL化學發光顯色液購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海源葉生物科技有限公司，BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐變性劑型)、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RNase抑制劑、ATP及脫脂奶粉購自上海碧云天生物技術有限公司，鼠抗His抗體購自Proteintech公司，HRP-羊抗鼠IgG購自蘇州博奧龍科技有限公司，硝酸纖維素(NC)膜購自Cytiva公司，透析袋(截留分子量14 kDa)購自上海翊圣生物科技有限公司，二硫蘇糖醇(DTT)購自北京索萊寶科技有限公司，DEPC購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，NaCl與MgCl2購自國藥集團上海有限公司，SpectraTM多色寬范圍蛋白分子量標準購自Thermo Fisher公司。

1.1.4 主要儀器

NanoDrop One超微量分光光度計、生物安全柜、低溫搖床及恒溫培養箱購自Thermo Fisher公司，高速離心機與渦旋振蕩儀購自Eppendorf公司，垂直電泳儀購自Bio-Rad公司，轉印儀購自上海天能科技有限公司，多功能成像儀與Typhoon多功能激光掃描儀購自Cytiva公司，掃描儀購自Epson公司，恒溫搖床購自Crystal公司，超聲波細胞破碎儀購自南京先歐儀器制造有限公司，多功能酶標儀購自Tecan公司，恒溫金屬浴購自上海米歐儀表機械制造有限公司，垂直電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 PEDV Nsp13重組表達質粒的鑒定

將pET28a(+)-PEDV Nsp13重組質粒轉入大腸桿菌Trans5α感受態細胞中，轉化液涂布于卡那霉素抗性的LB固體平板上，37 ℃恒溫培養箱培養過夜，挑取單克隆菌落接種到卡那霉素抗性的LB液體培養基中，37 ℃搖床培養，將菌液送至通用生物(安徽)股份有限公司測序，其測序結果與GenBank中PEDV(JX188454.1)的Nsp13序列進行比對。

1.3 PEDV Nsp13蛋白的可溶性表達

將pET28a(+)-PEDV Nsp13重組質粒轉入大腸桿菌Transetta(DE3)感受態細胞中，隨后將重組菌Transetta (DE3)/pET28a(+)-PEDV Nsp13接種于卡那霉素抗性的LB液體培養基，37 ℃ 200 r/min振蕩培養過夜。次日，以1∶100比例轉接至200 mL卡那霉素抗性LB液體培養基中，37 ℃ 200 r/min培養至OD600值達到0.6～0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，18 ℃誘導16 h。8 000 r/min離心15 min收集菌體，用20 mL的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液重懸菌體后，進行超聲破碎(350 W，工作3 s，間歇6 s)，至菌液澄清。8 000 r/min離心15 min，分別收集上清液與沉淀，取一半上清液經0.45 μm濾膜過濾。以上樣品進行10% SDS-PAGE分析蛋白表達情況。

1.4 PEDV Nsp13蛋白純化及條件優化

依次使用ddH2O和20 mmol/L Tris-HCl緩沖液清洗鎳親和層析柱，將大量表達的PEDV Nsp13蛋白所在上清液自由流穿層析柱。用含0、10、20、50、100 mmol/L咪唑的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液依次洗脫雜蛋白，再依次用200、300、500 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫目的蛋白，并采用10% SDS-PAGE分析其純化效果。

在上述條件未能得到較好純化效果的前提下，對鎳親和層析純化上樣速度進行優化。清洗層析柱后，將上清液流穿層析柱的速度由自由流穿降至1 min/mL，再用含0、10、20、50、100 mmol/L咪唑的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液依次洗脫雜蛋白，最后，依次用200、300、500 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫目的蛋白，采用10% SDS-PAGE分析其純化效果。

1.5 蛋白樣品的透析

剪取適當長度的透析袋(截留分子量為14 kDa),煮沸冷卻后加入純化的目的蛋白，將透析袋置于500 mL不含咪唑的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，置于磁力攪拌器上，4 ℃下低速旋轉透析過夜。

1.6 蛋白濃度測定

將純化透析后的蛋白樣品，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒，在562 nm波長下進行可見光吸收光譜測定，根據各濃度標準品吸光度繪制標準曲線，計算蛋白樣品濃度。

1.7 SDS-PAGE及Western blot鑒定

將誘導后Transetta (DE3)/pET28a(+)和純化透析后的蛋白樣品經10% SDS-PAGE分離，經考馬斯亮藍染色及脫色后進行成像。將上述樣品經10% SDS-PAGE分離并轉印至NC膜，隨后用5%脫脂奶于37 ℃封閉1 h；PBST洗滌5次，鼠源His抗體(1∶20 000稀釋)4 ℃孵育過夜；PBST洗滌5次，HRP-羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h；PBST洗滌5次，最后，使用ECL化學發光顯色液進行顯色，使用多功能成像儀成像，從而驗證PEDV Nsp13的正確表達和純化。

1.8 RNA底物的設計與制備

設計1對單鏈RNA序列(RNA1/RNA2)，構建體外RNA退火體系：10 mmol/L Tris，20 mmol/L NaCl，pH=7.5。RNA1與RNA2在此體系中經金屬浴95 ℃孵育5 min后冷卻至室溫，RNA1部分序列可以和RNA2全部序列退火為雙鏈，形成具有5′-overhang結構的雙鏈RNA，Cy5為熒光分子。

為避免解開的雙鏈RNA (RNA1/RNA2)自動退火為雙鏈，本研究設計1段trap RNA序列，該序列與RNA2序列反向互補，可與熒光標記的RNA1競爭結合RNA2序列。

1.9 PEDV Nsp13解旋活性鑒定

構建體外解旋反應體系(10 μL)：30 mmol/L Tris (pH=7.5)，0.1 mg/mL BSA，1%甘油，3 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT，4 U/μL RNase抑制劑，4 nmol/L dsRNA，8 nmol/L trap RNA，3 mmol/L ATP，60 nmol/L PEDV Nsp13。將上述液體混合后置于16 ℃反應10 min，與等體積的2×終止緩沖液(50 mmol/L EDTA·Na2·2H2O、1% SDS、10%甘油)混合后置于冰上，經10%非變性PAGE電泳3 h后，用Typhoon多功能激光掃描儀成像分析。

1.10 溫度對解旋活性的影響

根據1.9節構建體外解螺旋反應體系，將上述液體混合后分別置于16、25和37 ℃反應10 min，與等體積的2×終止緩沖液混合后置于冰上，經10%非變性PAGE分析3 h后，用Typhoon多功能激光掃描儀成像分析，并利用Image J軟件對解旋幅度進行定量分析，利用GraphPad軟件繪圖。

2 結果

2.1 PEDV Nsp13可溶性表達效果

經生物公司測序，測序結果與GenBank中PEDV (JX188454.1)的Nsp13序列進行比對，其氨基酸序列完全一致，表明重組質粒pET28a(+)-PEDV Nsp13構建成功。

通過10% SDS-PAGE驗證蛋白表達情況，結果顯示，含pET28a(+)-PEDV Nsp13重組質粒的大腸桿菌Transetta(DE3)通過IPTG誘導在70 kDa處有明顯條帶，大小與目的蛋白基本一致，且上清液中目的條帶較為明顯，而未經誘導的重組菌液在此處無明顯條帶(圖1)。表明在該誘導表達條件下，PEDV Nsp13成功表達且可溶性表達效果較好。

M.蛋白標準品；1.誘導前Transetta (DE3)菌體；2.誘導后Transetta (DE3)菌體；3.誘導后Transetta (DE3)上清液(過濾前)；4.誘導后Transetta (DE3)上清液(過濾后)；5.誘導后Transetta (DE3)沉淀。

2.2 PEDV Nsp13鎳親和層析純化及條件優化

對上清液中大量表達的PEDV Nsp13蛋白進行鎳親和層析純化。10% SDS-PAGE結果顯示，經純化后目的蛋白條帶過淺，目的蛋白濃度過低(圖2)，純化仍需進一步優化。

M.蛋白標準品；1.誘導前Transetta (DE3)菌體；2.誘導后Transetta (DE3)菌體；3.誘導后Transetta (DE3)沉淀；4.誘導后Transetta (DE3)上清液；5.蛋白上樣流穿液；6～9.咪唑洗脫液濃度分別為0、10、20 和50 mmol/L；10～13.咪唑洗脫液濃度均為100 mmol/L；14～16.咪唑洗脫液濃度均為200 mmol/L；17～19.咪唑洗脫液濃度均為300 mmol/L；20.咪唑洗脫液濃度為500 mmol/L。

10% SDS-PAGE結果顯示，上樣速度優化至1 min/mL，純化后在70 kDa附近有明顯單一條帶，且雜帶較少(圖3)。這一方案延長了目的蛋白His標簽與鎳親和層析柱的結合時間，有效增強了目的蛋白His標簽與鎳離子的結合效果，從而在洗脫液中得到濃度更高的目的蛋白。

M.蛋白標準品；1.誘導前Transetta (DE3)菌體；2.誘導后Transetta (DE3)菌體；3.誘導后Transetta (DE3)上清液；4.誘導后Transetta (DE3)沉淀；5.蛋白上樣流穿液；6～8.咪唑洗脫液濃度分別為0、10和20 mmol/L；9～10.咪唑洗脫液濃度均為50 mmol/L；11～12.咪唑洗脫液濃度均為100 mmol/L；13～16.咪唑洗脫液濃度均為200 mmol/L；17～20.咪唑洗脫液濃度均為300 mmol/L；21.咪唑洗脫液濃度為500 mmol/L。

2.3 PEDV Nsp13純化鑒定及濃度測定

將純化得到的PEDV Nsp13蛋白進行透析，從而去除絕大部分的咪唑，以避免咪唑殘留對后續解旋試驗的影響。將透析后得到的蛋白樣品，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行濃度測定，測定純化后的PEDV Nsp13蛋白濃度為0.9 mg/mL。對透析后收集到的蛋白進行SDS-PAGE和Western blot鑒定，結果顯示，在70 kDa附近有一明顯的特異性條帶(圖4)，表明通過前期試驗，準確得到了可溶性表達的PEDV Nsp13蛋白。

M.蛋白標準品；1.誘導后Transetta (DE3)/pET28a(+)；2.純化后的PEDV Nsp13。

綜上，通過在大腸桿菌系統中的可溶性表達及純化條件的優化，得到了較高純度的PEDV Nsp13蛋白，濃度為0.9 mg/mL。

2.4 PEDV Nsp13 RNA解旋活性的鑒定

對表達純化并透析后的PEDV Nsp13蛋白進行解旋活性鑒定。經95 ℃處理后的雙鏈RNA會變性為單鏈RNA，只有ATP或只有PEDV Nsp13的體系不能產生單鏈條帶。結果顯示，同時具有ATP和PEDV Nsp13的體系在16 ℃孵育10 min的條件下能夠產生單鏈條帶(圖5)，表明本研究可溶性表達純化得到的PEDV Nsp13具有ATP依賴的RNA解旋活性。

1.95 ℃處理對照；2.有ATP無PEDV Nsp13對照；3.有PEDV Nsp13無ATP對照；4.有ATP有PEDV Nsp13；黑色線段表示RNA鏈；五角星代表Cy5。

2.5 溫度對RNA解旋效果的影響

本研究設計了不同溫度條件下對PEDV Nsp13解旋效果的探究。使用Image J軟件分別對解旋幅度進行分析，結果顯示，在相同時間條件下，一定范圍內的溫度升高能夠提升PEDV Nsp13的解旋幅度(圖6)。

A.非變性PAGE結果，其中泳道1為95 ℃處理對照，2為有ATP無PEDV Nsp13對照，3為有PEDV Nsp13無ATP對照，4為有ATP有PEDV Nsp13 (16 ℃)，5為有ATP有PEDV Nsp13 (25 ℃)，6為有ATP有PEDV Nsp13 (37 ℃)，黑色線段表示RNA鏈，五角星代表Cy5；B.解旋幅度趨勢圖。

3 討論

3.1 PEDV Nsp13可溶性表達與純化分析

本文利用大腸桿菌表達系統對PEDV Nsp13進行可溶性表達。大腸桿菌表達系統具有周期短、成本低、操作簡便、表達量高等優點，是蛋白表達最常用的方法之一[13-14]。重組蛋白在大腸桿菌中表達時經常發生蛋白聚集，形成不可溶的、無活性的包涵體[15]，在純化過程中需要變性才能溶解，溶解后又需復性才能恢復蛋白質結構[16]，因此包涵體蛋白通常不具備蛋白質的天然結構和完整的生物功能。而PEDV Nsp13蛋白作為一種解旋酶，在上清液中的可溶性表達能夠使其在表達過程中避免形成錯誤的空間三維結構，從而避免了對其解旋酶活性的影響。

鎳親和層析技術作為一種常用的蛋白純化技術，其原理是填料中鎳離子與目的蛋白中的His標簽存在特異性相互作用，當二者結合后，再利用咪唑與目的蛋白中的His標簽競爭鎳離子，從而使目的蛋白被洗脫。而在實際操作中，由于雜蛋白與填料中的鎳離子存在一定的非特異性結合，其結合效果往往低于目的蛋白His標簽與鎳離子的特異性結合，因此常采用咪唑梯度洗脫的方式，使目的蛋白與雜蛋白在不同濃度的咪唑中被洗脫，從而實現目的蛋白與雜蛋白的分離。本研究在鎳親和層析純化環節，首先將目的蛋白所在上清液在重力作用下自由流穿鎳親和層析柱，并從低濃度到高濃度進行咪唑濃度梯度洗脫，最終在洗脫液中得到的目的蛋白條帶較淺；通過對上清液流速的優化，最終在流速1 mL/min的方案下，在洗脫液中得到了更大濃度的目的蛋白。該上樣流速既能夠避免目的蛋白與鎳離子結合時間過短，造成目的蛋白的損失，也能夠避免結合時間過長，造成雜蛋白非特異性結合效果增強，純化后蛋白樣品中雜蛋白濃度過大。

本研究通過大腸桿菌表達系統和鎳親和層析技術，經過10% SDS-PAGE、Western blot及濃度測定，驗證了該可溶性表達純化方案能夠得到0.9 mg/mL較高純度PEDV Nsp13蛋白，以便開展后續試驗。

3.2 PEDV Nsp13解旋活性分析

本研究中設計了1組單鏈RNA底物，使用Cy5熒光分子標記其中1條RNA單鏈，退火后能夠形成5′-overhang結構，通過10%非變性PAGE分離單鏈RNA與雙鏈RNA，并利用Typhoon多功能激光掃描儀采集信號并成像。由于熒光標記單鏈RNA與退火形成的帶有熒光標記的雙鏈RNA的相對分子質量不同，在相同時間內具有不同的遷移距離，可以直觀展現單雙鏈RNA的位置，并結合數據分析，能夠計算其退火或解旋的幅度。由于在試驗過程中存在雙鏈RNA解旋后重新自動退火的情況，對試驗數據造成較大影響，因此本研究設計了1條無熒光標記的trap RNA，能夠競爭結合無熒光標記的RNA2[17]，且不影響熒光單鏈的成像結果。

利用本研究可溶性表達純化的PEDV Nsp13蛋白，結合1組RNA底物的設計及1套體外解旋反應體系的建立，發現PEDV Nsp13蛋白能夠解旋本研究設計并退火的5′-overhang RNA底物，驗證了本研究表達純化的PEDV Nsp13蛋白具有RNA解旋活性，并且驗證了PEDV Nsp13的5′→3′的RNA解旋極性，與Ren等[8]研究結果一致。

此外，本研究還對PEDV Nsp13蛋白與雙鏈RNA底物解旋在16、25和37 ℃溫度下解旋情況進行了探究。結果表明，在10 min反應時間內，PEDV Nsp13的RNA解旋活性隨溫度的升高而升高，進一步驗證了本研究表達純化得到的PEDV Nsp13的RNA解旋活性。由于PEDV Nsp13是一種解旋酶，而酶類通常在其最適溫度下具有最佳的酶活性，因此可以推測，PEDV解旋酶Nsp13在RNA解旋過程中的反應溫度越接近其最適溫度，相同時間內的解旋幅度越大。從微觀角度考慮，溫度的升高使得反應物分子熱運動加快，提高了單位時間的有效碰撞次數，并且能夠增加反應物中活化分子數，使得解旋進程加快，從另一個角度解釋了在相同時間內解旋幅度提高的原因。

4 結論

本研究利用大腸桿菌表達系統可溶性表達并純化得到了濃度為0.9 mg/mL的較高純度PEDV Nsp13蛋白，并通過1組RNA底物的設計以及1套體外解旋反應體系的建立，驗證了表達純化得到的PEDV Nsp13蛋白的RNA解旋酶活性，在此基礎上，通過對相同時間內16、25和37 ℃溫度條件下RNA解旋效果的比較，發現PEDV Nsp13蛋白RNA解旋酶活性在一定范圍內隨解旋溫度的升高而提高。