豬圓環病毒2型ORF1部分位點突變對病毒復制能力的影響

李荷然，肖琦，溫立斌，朱雪蛟，芮榮，何孔旺*

(1.南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業農村部獸用生物制品工程技術重點實驗室/江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 南京 210014)

豬圓環病毒2型(PCV2)是一種無囊膜的單股負鏈環狀DNA病毒，可通過口鼻黏膜直接或間接通過接觸糞、尿或病豬等發生水平傳播，也可以通過胎盤垂直傳播[1]，是臨床上引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)的主要病因[2-5]，給養豬業造成巨大的經濟損失[6-7]。PCV2有2個主要的開放閱讀框(ORF)：編碼衣殼蛋白(Cap)的ORF2和編碼復制相關蛋白的ORF1。PCV2 ORF1所表達的Rep蛋白及經過剪切的Rep′蛋白對病毒DNA的復制至關重要[8-10]。本實驗室前期在探索PCV2 Rep在體外對PK-15細胞影響的過程中，構建2～6 aa和17～21 aa點突變的雙拷貝感染性克隆質粒時發現，將PCV2 Rep某些位點上的氨基酸單個或多個突變為丙氨酸后PCV2點突變病毒拯救失敗。為了找到突變后不影響病毒拯救的位點，本研究通過構建PCV2 ORF1不同位點突變的雙拷貝感染性克隆質粒并進行病毒拯救，使用熒光定量PCR(qPCR)檢測PCV2點突變株的復制能力，為探究Rep蛋白影響PCV2復制的關鍵作用位點提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒和主要試劑

PK-15細胞、PCV2d毒株、pBluescript Ⅱ SK(+)載體由江蘇省農業科學院獸醫研究所提供。

胎牛血清(FBS)、高糖 DMEM、胰酶，購自中國Gibco公司；GreenTaqMix、2×Phanta Max Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Trans 5α感受態細胞，購自北京全式金生物技術股份有限公司；Uniclone One Step Seamless Cloning Kit，購自北京金沙生物科技有限公司；Lipofectamine 3000轉染試劑盒，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 引物設計

根據PCV2d的基因序列及無縫克隆試劑盒說明書設計PCV2 Rep不同位點氨基酸點突變為丙氨酸所需的引物。構建PCV2及PCV2點突變株雙拷貝所需的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 構建PCV2點突變單拷貝感染性克隆質粒

以pSK載體為模板，XbaⅠ和BamHⅠ為酶切位點進行雙酶切，雙酶切后進行膠回收。以PCV2環狀病毒為模板，使用XbaⅠ酶對其預線化。使用含有上游載體重疊區域、酶切位點與PCV2正向特異性擴增序列的引物2-Uni-F1，與包含目的堿基突變的下游引物進行PCR擴增，獲得插入片段1；使用包含目的堿基突變的上游引物，與含有下游載體重疊區域、酶切位點與反向特異性擴增序列的引物2-Uni-R2進行PCR擴增，獲得插入片段2。按照無縫克隆試劑盒說明書配置體系，將載體、插入片段1和插入片段2進行重組反應，轉入Trans5α感受態，挑菌搖菌后使用載體通用引物(M13-F和M13-R)進行PCR檢測，選擇重組成功的菌株送測序，測序正確的菌株搖菌擴增，提取質粒，測量濃度后保存備用。

M.DL2000 Marker；1.PCV2 點突變單拷貝感染性克隆質粒。

1.4 構建PCV2及PCV2點突變雙拷貝感染性克隆質粒

以pSK載體為模板，XbaⅠ和BamHⅠ為酶切位點進行雙酶切，雙酶切后進行膠回收。以PCV2環狀病毒或PCV2點突變單拷貝質粒為模板，使用XbaⅠ酶對其預線化。使用2-Uni-F1和2-Uni-R1引物進行PCR擴增，插入片段3；使用在5′端插入了與片段3的3′端序列重復的2-Uni-F2，和2-Uni-R2一起進行PCR擴增，獲得插入片段4。按照無縫克隆試劑盒說明書配置體系，將載體、插入片段3和插入片段4進行重組反應，轉入Trans5α，挑菌搖菌后使用630-F和630-R引物進行PCR檢測，將在630 bp處有特異性條帶的PCR產物送測序，若測序結果正確則說明PCV2雙拷貝感染性克隆質粒或PCV2點突變雙拷貝感染性克隆質粒構建成功。將構建成功的PCV2雙拷貝感染性克隆質粒命名為pSK-PCV2，根據不同的突變位點將PCV2點突變雙拷貝感染性克隆質粒分別命名為pSK-3aa、pSK-5aa、pSK-2-4aa、pSK-4-6aa、pSK-3-6aa、pSK-2-6aa、pSK-17aa、pSK-18aa、pSK-19aa、pSK-20aa、pSK-21aa、pSK-17-19aa和pSK-17-21aa。

1.5 感染性克隆質粒的轉染

將無PCV2污染的PK-15細胞鋪于T25細胞瓶中，37 ℃培養至細胞鋪滿單層。按照Lipofectamine 3000轉染試劑盒說明書分別將pSK-PCV2、pSK-3aa、pSK-5aa、pSK-2-4aa、pSK-4-6aa、pSK-3-6aa、pSK-2-6aa、pSK-17aa、pSK-18aa、pSK-19aa、pSK-20aa、pSK-21aa、pSK-17-19aa、pSK-17-21aa以及空載體pSK轉染PK-15細胞并記錄為第0代，連續帶毒傳代，收取上清液使用熒光定量PCR的方法檢測Ct值。若Ct值無明顯變化，則吸取1 mL收取的上清液接毒無PCV2污染的PK-15細胞盲傳6代后再進行檢測；若Ct值持續升高則停止傳代。

2 結果與分析

2.1 PCV2點突變單拷貝感染性克隆質粒構建

構建的所有PCV2點突變單拷貝感染性克隆質粒無縫克隆后，挑菌使用M13通用引物進行菌液PCR，陽性菌均應得到大小為1 964 bp的擴增產物(圖1)。菌液進行測序，測序結果顯示相關位點突變成功，說明點突變單拷貝感染性克隆質粒構建成功(圖2)。

圖2 PCV2 ORF1部分位點突變

M.DL2000 Marker；1.PCV2雙拷貝感染性克隆質粒。

2.2 PCV2及PCV2點突變雙拷貝感染性克隆質粒構建

以PCV2雙拷貝感染性克隆質粒的構建為例。pSK載體、包含pSK載體上游重疊區域的PCV2全長或點突變PCV2全長的片段3，及包含pSK載體下游重疊區域的PCV2全長或點突變PCV2全長的片段4進行無縫克隆后挑菌；使用引物630-F和630-R進行菌液PCR，若在630 bp處有明顯的條帶，判定為陽性(圖3)，測序結果正確，說明雙拷貝正確連接，PCV2雙拷貝感染性克隆質粒構建成功。

2.3 3 aa、5 aa和18 aa點突變后PCV2復制能力

pSK-PCV2、pSK-3aa、pSK-5aa和pSK-18aa轉染后傳至第3代，用收獲的上清液接毒無PCV2污染的PK-15細胞并盲傳6代，吸出200 μL收獲的上清液用于病毒DNA提取，并使用PCV2 ORF2檢測引物進行熒光定量PCR，檢測Ct值。若模板濃度太高，將DNA稀釋后再進行檢測。結果顯示，3 aa點突變株、5 aa點突變株和18 aa點突變株Ct值與PCV2原毒株相比均有降低，說明點突變后PCV2復制能力增強(表2)。熔解曲線顯示PCV2 ORF2檢測引物能有效檢測PCV2點突變株和原毒株(圖4)。

A.3 aa點突變株；B.5 aa點突變株；C.18 aa點突變株；D.原毒株。

2.4 4～6 aa和3～6 aa點突變后PCV2復制能力

pSK-4-6aa和pSK-3-6aa轉染后連續傳至3代，收獲上清液接毒無PCV2污染的PK-15細胞并盲傳6代，各吸出200 μL提取DNA并使用PCV2 ORF2檢測引物進行熒光定量PCR檢測Ct值，若模板濃度太高，將DNA稀釋再進行檢測。結果顯示4～6 aa點突變株和3～6 aa突變株復制能力減弱(表3)。

表3 4～6 aa和3～6 aa點突變株與PCV2原毒株上清液Ct值

2.5 2～4 aa、2～6 aa、17～19 aa點突變后PCV2復制能力變化

pSK-2-4aa、pSK-4-6aa和pSK-17-19aa轉染后連續傳代，最多傳至第6代，每代提取DNA進行熒光定量PCR檢測Ct值，結果顯示Ct值持續上升，說明病毒復制能力明顯減弱(表4)。

表4 2～4 aa、17～19 aa和2～6 aa點突變株與PCV2原毒株上清液Ct值

2.6 17 aa、19 aa、20 aa、21 aa和17～21 aa點突變后PCV2拯救情況

pSK-17aa、pSK-19aa、pSK-20aa、pSK-21aa和pSK-17-21aa轉染后連續傳代，最多傳至第6代，每代提取DNA進行熒光定量PCR檢測Ct值，結果顯示Ct值持續上升至30以上，說明17 aa、19 aa、20 aa和21 aa點突變后嚴重抑制了病毒的復制能力，這4個位點對PCV2的復制起到關鍵作用(表5)。

表5 17 aa、19 aa、20 aa、21 aa和17～21 aa點突變株與PCV2原毒株上清液Ct值

3 討論

PCV有4種血清型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。PCV1和PCV2廣泛存在，目前普遍認為PCV1無致病性[11-12]，而PCV2是導致PMWS的主要因素。PCV1病毒的復制起點位于2個主要的開放閱讀框ORF1和ORF2之間的頸環結構上，由Rep和剪切后的Rep′在結構保守九聚體的第7、8堿基之間進行切割與連接[13]，PCV2與PCV1的基因組具有高度同源性，二者與病毒復制相關的起點及Rep基因都是保守的[14]。與PCV1類似，PCV2中同樣存在2個以上剪切后的Rep′，全長Rep和Rep′是PCV2復制所必需的[15]。本研究通過無縫克隆，在不影響Rep全長的情況下將個別氨基酸突變為丙氨酸，轉染PK-15細胞后，通過qPCR檢測PCV2及PCV2突變株的復制情況。

本研究首先對PCV2 Rep的2～6 aa和17～21 aa進行了突變，轉染細胞后傳至第4代，發現病毒載量隨細胞傳代而不斷降低，且17～21 aa點突變株的Ct值上升至31.678，一般在Ct值為35時可以認為檢測結果為陰性，因此認為17～21 aa突變后PCV2無法復制。為進一步探究影響PCV2復制的具體位點，構建一系列不同位點突變的PCV2點突變株，結果顯示：3 aa、5 aa和18 aa分別突變后PCV2的復制能力增強，在細胞中的載量明顯高于PCV2原毒株；2～4 aa和17～19 aa突變后病毒載量隨細胞傳代持續降低；4～6 aa和3～6 aa突變后病毒能被成功拯救但復制能力與PCV2原毒株相比減弱；而17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突變后病毒均無法成功拯救。以上結果顯示，PCV2 Rep 17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是PCV2復制的關鍵位點，對其中任意一個位點進行突變，PCV2都無法通過感染性克隆進行拯救，其復制能力受到嚴重的影響。PCV2 Rep 2 aa也可能是PCV2復制的關鍵位點，與不包含2 aa突變的3～6 aa突變相比，包含2 aa突變的2～4 aa突變和2～6 aa突變在進行病毒拯救的過程中呈現Ct值緩慢上升的狀態且Ct值明顯高于3～6 aa突變，顯示出2 aa突變對PCV2的復制產生影響。3 aa和5 aa突變后PCV2復制能力增強，已有研究證明6 aa突變后可使PCV2的復制能力增強[16]，但3～6 aa突變后PCV2雖然能拯救但病毒復制能力下降，說明4 aa突變后降低了PCV2的復制能力。

已有研究結果表明，ssDNA可通過與Rep特定蛋白質直接接觸，或通過有U型構象的凹槽與Rep對接從而進行間接接觸，Rep蛋白的17 aa至21 aa位于該結構的同一個β折疊上[17]。因此，PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa可能正是Rep與ssDNA相互作用或幫助Rep形成相關空間結構的關鍵位點，改變相關氨基酸可抑制或減弱Rep與ssDNA的相互作用，從而對PCV2的復制產生了不利的影響。

總之，本文探究了Rep蛋白影響PCV2復制的關鍵位點，為后續開展PCV2復制相關研究奠定了基礎。