復合乳酸菌和留茬高度對倒伏燕麥青貯品質調控研究

蔣永梅,關 皓,李海萍,汪 輝,陳有軍,賈志鋒,劉文輝,陳仕勇,梁 驥,周青平,

(1.青海大學畜牧獸醫科學院,青海省青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室,青海 西寧 810016; 2. 西南民族大學四川若爾蓋高寒濕地生態系統國家野外科學觀測研究站,四川 成都 610041; 3. 四川文理學院化學化工學院,四川 達州 635000; 4. 西南民族大學畜牧獸醫學院,四川 成都 610041)

我國南方地區冬閑田面積約占耕地面積的50%～60%,部分區域高達80%～90%,有些地方甚至全部撂荒[1]。大面積的冬閑田成為真正的“閑置田”,為雜草滋生創造有利條件,導致土壤肥力下降[2]。2023年中央1號文件指出,構建多元化食物供給體系,樹立大食物觀,大力發展青貯飼料,加快推進秸稈養畜。秋季利用冬閑田進行草田輪作,可以在不影響水稻、玉米等糧食作物播種的前提下,多種一季飼草,保障家畜飼草料供給。

燕麥(AvenasativaL.)具有喜冷涼、耐貧瘠,營養價值豐富,中性洗滌纖維含量較低且適口性好的特點,是南方地區冬閑田種植的優勢作物之一[3-4]。青貯可更好的保留飼草的新鮮程度,貯藏時間長且養分流失較少,是南方地區燕麥加工利用的主要方法[5]。然而,南方地區受強降雨和大風等不利天氣的影響,燕麥易發生倒伏,使葉片的空間分布和冠層結構打亂,引起莖葉等光合器官相互遮蔽,影響通風透光,致使莖稈底部的葉片變黃并腐爛,滋生有害微生物[6-8],同時燕麥倒伏后因接觸土壤,在收獲時會不可避免的將腐敗燕麥植株和底部土壤帶入,不僅不易機械收割,還會導致燕麥青貯的品質受到負面影響,已成為制約南方地區冬閑田種植燕麥的瓶頸問題。

目前,青貯品質的調控研究主要集中在青貯方式[9]、貯藏時間[10]、添加劑[11-12]、留茬高度[9,13]等方面。研究表明,乳酸菌能夠將可溶性碳水化合物轉化為乳酸和乙酸,快速降低pH,抑制不良微生物繁殖,發揮保存青貯飼料營養品質以及防止青貯飼料變質作用[14];留茬高度增加可提高植物葉莖比,促進發酵過程中可溶性碳水化合物增加,同時帶入泥土減少,降低土壤中腸桿菌等微生物競爭利用發酵底物,從而使乳酸菌產生更多的有機酸,進而改善發酵品質[15]。楊晶晶等[16]研究發現乳酸菌劑和留茬高度可改善倒伏全株玉米青貯品質、減少養分損失。那么,倒伏燕麥青貯品質的調控是否也與倒伏玉米一致,受乳酸菌和留茬高度的影響?然而查閱文獻發現,關于對倒伏燕麥青貯品質調控鮮見報道,在實際生產過程中,倒伏燕麥依舊會被刈割收獲制作青貯,但倒伏后適宜收獲的留茬高度以及乳酸菌的添加是否能減少倒伏對燕麥青貯的不利影響還不得而知,基于此,本研究通過探討復合乳酸菌和留茬高度對倒伏燕麥青貯品質、微生物組成及發酵品質的影響,明確倒伏燕麥青貯較優的調制手段,以期為盡可能減少倒伏對燕麥青貯造成的損失提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 采樣區概況

采樣地位于國家草品種試驗基地(四川新津),103°45′E,30°29′N,平均海拔478 m,屬亞熱帶濕潤季風氣候,年降雨量1 902 mm,最高氣溫39.1℃,最低氣溫17.6℃,平均相對濕度79%,平均風速1.4 m·s-1(數據來源:https://rp5.ru)。

1.2 試驗材料

供試材料為燕麥(AvenasativaL.),品種為‘青海444’,于2021年10月播種,播種量為75 kg·hm-2,條播,行距為30 cm,小區面積為15.3 m2(3 m×5.1 m),底肥為60 kg·hm-2磷肥(含12% P2O5),分蘗期追施70 kg·hm-2尿素(含46%N)。

供試菌株為植物乳桿菌149(Lactobacillusplantarum,專利號:CN108060104B)和鼠李糖乳桿菌753(Lactobacillusrhamnosus,專利號:CN110591988B)按照1∶1混合。

1.3 青貯制作

采用雙因素試驗設計,添加乳酸菌處理有未接種乳酸菌(添加等量的無菌水)和接種乳酸菌(濃度為106cfu·mL-1左右,添加量為3%)2個水平,根據倒伏燕麥貼近地面植株長度(圖1),留茬高度設置分別為0 cm(H1),15 cm(H2),30 cm(H3),45 cm(H4),試驗共8個處理(表1),每個處理3次重復。

表1 試驗處理編號Table 1 The number of treatments

圖1 倒伏燕麥示意圖Fig.1 The diagram of lodging oats

試驗于2022年5月1日采用人工刈割方式對乳熟期倒伏燕麥(拔節期開始倒伏,倒伏持續時間為45天)進行刈割,留茬高度分別為0,15,30 和45 cm,將刈割后的倒伏燕麥立即用揉絲機切碎為1～2 cm,并進行混勻。稱取400 g左右的樣品(含水量為70.20%～79.06%)按照3%接種量噴灑復合乳酸菌劑(濃度為106cfu·mL-1左右),對照噴灑等量的無菌蒸餾水,混合均勻后裝入聚乙烯塑料袋中(260 mm×350 mm)壓實后抽真空,每個處理設為3個重復,置于室溫環境中進行發酵。青貯60 d后開袋,將青貯樣品混勻后,稱取20 g與180 mL無菌蒸餾水混合均勻用于青貯微生物組成和發酵品質的測定。取300 g左右青貯樣品置于烘箱中烘干至恒重,用粉碎機粉碎后用于營養品質測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1營養品質 將各處理青貯樣品置于65℃烘箱中烘干至恒重測定干物質(Dry matter,DM)含量,并將烘干的樣品用粉碎機粉碎,過1 mm篩用于營養品質的測定?？扇苄蕴妓衔?Water soluble carbohydrate,WSC)用蒽酮-硫酸比色法測定,粗蛋白質(Crude protein,CP)利用凱氏定氮法測定,中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)用范氏(Van Soest)洗滌纖維法測定,粗灰分(Ash)采用馬弗爐灼燒測定[17]。

1.4.2發酵品質 稱取20 g青貯樣品置于裝有180 mL蒸餾水自封袋,經1 000 r·min-1,4℃下搖床上振蕩30 min后用雙層紗布過濾,采用pH計測定濾液的pH值,用高效液相色譜儀測定乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)及丁酸(Butyric acid,BA)含量[17]。

1.4.3微生物組成 原料和青貯樣品中微生物組成采用平板計數法測定[17]。乳酸菌數量采用MRS培養基在37℃厭氧培養箱中培養48 h,酵母菌和霉菌數量采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養基在有氧培養箱中培養72 h,腸桿菌數量采用結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基(VRBA)在37℃有氧培養箱中培養24 h。選取30～300個菌落數的平板進行計數,并按以下公式計算:菌數(cfu·g-1)=同一稀釋度的重復平板上菌落平均數×稀釋倍數/含菌樣品克數。

1.5 數據分析與處理

試驗數據用Excel 2019.0軟件進行整理,采用SPSS 25.0軟件進行獨立樣本T檢驗、雙因素方差分析和主成分分析,并通過Duncan法進行多重比較。用Origin 21.0軟件作圖,分析青貯指標間的相關性。運用隸屬函數法對青貯品質指標轉化后進行主成分分析,其中與青貯品質呈正相關的指標用公式(1),與青貯品質呈負相關的指標用公式(2)。

Fi=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

Fi=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中:Fi表示各指標的隸屬函數值,Xi表示該指標的測定值;Xmax表示該指標的最大值;Xmin表示該指標的最小值。

2 結果與分析

2.1 倒伏燕麥原料特性

由表2可見,倒伏燕麥原料干物質含量為18.50%～22.43%FW,WSC含量為0.97%～1.55%DM,其中留茬高度為30 cm時,DM,WSC含量最低。CP含量為8.75%～10.27%DM,NDF和ADF含量分別為39.29%～51.09%DM,20.94%～29.80%DM,Ash含量為7.23%～8.54%DM,乳酸菌、霉菌、酵母菌和腸桿菌數量分別為2.01～2.60,4.15～4.41,3.62～3.81,4.33～5.13 lg·cfu·g-1FM。隨著留茬高度的增加,CP含量顯著增加(P<0.05),Ash含量、乳酸菌數量呈先下降后上升的趨勢(P<0.05),NDF和ADF含量、霉菌數量呈先上升后下降的趨勢,腸桿菌數量呈下降趨勢(P<0.05),而對酵母菌數量沒有顯著影響。其中,留茬高度為45 cm時倒伏燕麥原料CP含量最高,NDF含量最低。

表2 倒伏燕麥原料化學成分及微生物Table 2 Chemical composition and microbial composition of lodging oat material before ensiling

2.2 復合乳酸菌和留茬高度對倒伏燕麥青貯營養品質及微生物組成的影響

由表3可見,相同留茬高度,接種復合乳酸菌增加DM,WSC,CP含量(留茬高度為30 cm除外),降低DM loss,NDF,ADF,乳酸菌數量,其中對留茬高度為0 cm和45 cm時DM loss、留茬高度為45 cm NDF和ADF含量,留茬高度為30 cm的WSC含量具有顯著影響(P<0.05)。不同留茬高度,JH4處理DM含量顯著低于其他留茬高度(P<0.05),H4和JH4處理NDF、ADF含量顯著低于其他留茬高度(P<0.05),H4和JH4處理CP含量顯著高于其他留茬高度(P<0.05),而在其余處理下不同留茬高度間無顯著影響。所有處理倒伏燕麥青貯后均未檢測到霉菌、酵母菌及腸桿菌。接種復合乳酸菌對倒伏燕麥青貯DM loss,CP,NDF,ADF和乳酸菌數量具有極顯著影響(P<0.01),對DM和WSC含量有顯著影響(P<0.05),不同留茬高度除對DM loss和WSC含量無顯著影響外,而對其他指標具有極顯著影響(P<0.01)。接種復合乳酸菌和不同留茬高度的交互作用對倒伏燕麥青貯CP,NDF,ADF,乳酸菌數量均有極顯著影響(P<0.01),而對其他青貯指標沒有影響。綜上,接種復合乳酸菌,倒伏燕麥青貯乳酸菌數量下降,JH4處理青貯CP含量最高、NDF和ADF含量最低。

2.3 復合乳酸菌和留茬高度對倒伏燕麥青貯發酵品質的影響

由表4可見,相同留茬高度,接種復合乳酸菌顯著降低倒伏燕麥青貯pH和AA含量(留茬高度為15 cm除外)、NH3-N/TN,PA含量(P<0.05),顯著增加了LA含量(P<0.05)。所有倒伏燕麥青貯均未檢測到BA含量。隨著留茬高度的增加,倒伏燕麥青貯pH,LA,PA含量下降,AA含量上升,其中接種復合乳酸菌+留茬高度為45 cm處理青貯pH和PA含量顯著低于其他處理。接種復合乳酸菌、不同留茬高度對青貯pH,NH3-N/TN,LA,AA,PA均有極顯著影響(P<0.01),接種復合乳酸菌和不同留茬高度的交互作用對NH3-N/TN,LA,AA,PA均有極顯著影響,對pH具有顯著影響。

表4 復合乳酸菌和留茬高度對倒伏燕麥青貯發酵品質的影響Table 4 Effects of compound lactobacillus and cutting height on lodging oat silage fermentation quality

2.4 倒伏燕麥青貯指標間的相關性分析

由圖2可知,DM含量與LA呈極顯著正相關(P<0.01),與Ash呈極顯著負相關(P<0.01),與DM loss、乳酸菌、NH3-N/TN呈顯著負相關(P<0.05)。DM loss與發酵品質(除LA外)呈極顯著正相關(P<0.01),與Ash呈顯著正相關(P<0.05),與WSC呈顯著負相關(P<0.05)。WSC含量與發酵品質(除LA和AA外)呈極顯著負相關(P<0.01),與Ash呈顯著負相關(P<0.05)。CP含量與PA呈極顯著負相關(P<0.01),與pH顯著負相關(P<0.05)。NDF與ADF,NH3-N/TN,AA呈極顯著正相關(P<0.01),與pH呈顯著負相關(P<0.05)。ADF與AA呈顯著正相關(P<0.05)。Ash與pH、PA呈極顯著正相關(P<0.01),與LAB呈顯著正相關(P<0.05),與LA呈極顯著負相關(P<0.01)。LAB與發酵品質(除LA和AA外)呈極顯著正相關(P<0.01)。pH與發酵品質(除LA和AA外)呈極顯著正相關(P<0.01)。NH3-N/TN與AA、PA呈極顯著正相關(P<0.01),與LA呈極顯著負相關(P<0.01)。LA與PA呈極顯著負相關(P<0.01)。

圖2 倒伏燕麥青貯指標間的相關性分析Fig.2 Correlation analysis on the indicators of lodging oat silage注:“*”表示相關性顯著(P<0.05);“**”表示相關性極顯著(P<0.01)Note:“*” mean a significant level of correlation (P<0.05);“**” an extremely significant level of correlation (P<0.01)

2.5 倒伏燕麥青貯品質綜合評價

將青貯品質數據經隸屬函數法轉化后進行主成分分析(表5),第1主成分的方差貢獻率為54.86%,第2主成分的方差貢獻率為19.08%,第3主成分的方差貢獻率為12.68%,前3個主成分的累積方差貢獻率為86.62%,符合主成分分析的要求。因此,采用3個主成分分析可以代表倒伏燕麥青貯品質的變異信息。

表5 主成分的因子載荷量、特征值與貢獻率Table 5 Loading factor,eigenvalue and contribution rate of principal components

表6 倒伏燕麥青貯品質綜合得分與排序Table 6 Comprehensive score and ranking of silage quality of lodging oats

根據特征向量與標準化的數據相乘得到以下主成分的表達式:

Y1=0.206X1+0.320X2+0.311X3+0.246X4+0.236X5+0.177X6-0.220X7-0.316X8+0.360X9+0.333X10+0.294X11-0.193X12+0.314X13

Y2=-0.324X1+0.192X2+0.025X3-0.077X4+0.445X5+0.476X6+0.333X7+0.216X8-0.136X9+0.150X10-0.287X11-0.377X12-0.065X13

Y3=-438X1-0.271X2+0.008X3+0.507X4+0.221X5+0.230X6-0.139X7-0.031X8+0.041X9-0.241X10-0.085X11+0.448X12+0.297X13

由公式Y=0.549×Y1+0.191×Y2+0.127×Y3計算不同處理青貯品質的綜合得分并排序(見表5),綜合得分越高,品質越佳。由此可得出,接種復合乳酸菌+留茬高度為45 cm處理青貯品質最佳。

3 討論

3.1 倒伏燕麥原料特性

青貯前飼料本身的營養品質及其微生物組成影響青貯發酵過程[18]。本研究發現,倒伏燕麥原料干物質含量為18.50%～22.43%FW,WSC含量為0.97%～1.55%DM。DM和WSC含量較低可能與燕麥倒伏后,正常的冠層結構被破壞,植物光合作用減弱,有氧呼吸受到抑制,導致植株腐爛,植物生長受阻以及倒伏阻礙了木質部和韌皮部水、營養物質的運輸有關[19]。本研究結果顯示,CP含量隨留茬高度的增加呈上升趨勢,究其原因可能是燕麥在拔節期倒伏,CP的積累源于抽穗前期葉片中積累的氮[20]。留茬高度低,采取樣品的腐爛程度相對較高,植株體內營養成分也隨之減少,留茬高度高,采取的植株體內營養成分會隨腐爛程度的降低而增加,同時留茬高度高也會增加采取燕麥植株頂部的機率,燕麥植株頂部相比底部其纖維化程度較低,同時受豐富葉片和種子的影響,其粗蛋白質含量也相對較高。Ash含量隨留茬高度的增加呈先下降后上升的趨勢(P<0.05),其原因可能是留茬高度為0 cm采樣時易帶入土壤,留茬高度15 cm和30 cm植株倒伏腐爛程度高于留茬高度45 cm。DM含量隨著留茬高度的增加呈先下降后上升的趨勢,這與Kennington等[21]研究結果不一致,可能是原料中莖稈比重減少、葉片比重增加,且葉片中DM含量低于莖稈。而留茬高度為45 cm DM含量顯著高于留茬高度30 cm,可能是因為刈割貼近土壤部分的植株較少。NDF和ADF含量隨留茬高度的增加呈先上升后下降的趨勢,這可能與燕麥倒伏后附著的土壤有關,土壤中含有能分解纖維素的微生物,隨著留茬高度由0 cm增加為30 cm,分解纖維素的微生物減少,使NDF和ADF含量上升,留茬高度為45 cm時,貼近土壤的植株基本不會被刈割,葉片和籽實比重增加,莖稈比重降低,降低了NDF和ADF[15]。

牧草表面附著大量的與其長期共存微生物,受環境等因素的影響,其種類和數量存在很大差異,在青貯過程中微生物演替變化影響青貯發酵品質[18]。本研究發現,乳酸菌數量為2.01～2.60 lg cfu·g-1FM,遠低于青貯成功的最低條件[18],霉菌、酵母菌和腸桿菌數量分別為4.15～4.41 lg cfu·g-1FM,3.62～3.81 lg cfu·g-1FM,4.33～5.13 lg cfu·g-1FM,相對來說較高,究其原因可能是燕麥倒伏后為有害微生物滋生提供有利條件。隨著留茬高度的增加,乳酸菌數量呈先下降后上升的趨勢,可能與燕麥倒伏后植株相互遮蔽為乳酸菌生長提供厭氧環境有關;霉菌數量呈先上升后下降的趨勢,腸桿菌數量呈下降趨勢,這可能與燕麥倒伏后植株附著的土壤有關[15]。

3.2 復合乳酸菌和留茬高度對倒伏燕麥青貯品質及微生物組成的影響

青貯營養品質是評價青貯飼料飼用價值的重要指標之一[10]。相同留茬高度,接種復合乳酸菌增加了DM、WSC和CP,降低了DM loss,NDF,ADF和乳酸菌數量,這可能是因為外源乳酸菌增加青貯DM含量,減少干物質損失,此外,接種的乳酸菌可能破壞了纖維結構,從而降低了青貯中纖維素含量。在本研究中,接種復合乳酸菌顯著降低青貯中乳酸菌數量,可能是因為外源乳酸菌在青貯發酵初期起關鍵作用,青貯后期,較低的pH抑制了乳酸菌生長[22]。接種復合乳酸菌顯著增加WSC、CP含量,這與王挺等[10]和李小玲等[12]研究結果不一致,說明在青貯過程中,添加的乳酸菌迅速降低了pH,從而抑制了不良微生物的生長,減少了對WSC的消耗和CP的分解,這一研究結果與肖燕子等[23]研究結果相似。本研究發現,所有處理青貯后均未檢測到霉菌、酵母菌、腸桿菌,這可能是在青貯發酵過程中乳酸菌的大量增殖使其成為優勢種,pH迅速降低,從而抑制了霉菌等的生長。隨著留茬高度的增加,接種乳酸菌處理青貯DM,NDF,ADF,Ash含量下降,CP含量增加,乳酸菌數量減少,這與原料特性有關,另外受復合乳酸菌和不同留茬高度交互作用影響。JH4處理青貯DM,NDF,ADF含量顯著低于其他處理,CP含量顯著高于其他處理,說明該處理可以改善倒伏燕麥青貯營養品質。綜上可見,留茬高度是改善倒伏燕麥青貯品質措施之一,留茬高度過低,倒伏燕麥腐爛嚴重,且易帶入土壤,從而使有害微生物大量增殖,不利于青貯的發酵,而隨著留茬高度的增加,倒伏燕麥品質得到改善[16]。

3.3 復合乳酸菌和留茬高度對倒伏燕麥發酵品質的影響

pH、氨態氮/全氮(NH3-N/TN)、有機酸含量是衡量青貯料發酵品質關鍵的指標[24]。本研究結果顯示,相同留茬高度,接種復合乳酸菌顯著降低倒伏燕麥青貯pH和AA含量(除留茬高度為15 cm)、NH3-N/TN、PA含量,顯著增加LA含量,說明在發酵后期,添加外源乳酸菌使青貯中LA含量增加,pH降低,酸性環境抑制好氧細菌和乳酸菌生長,使青貯后乳酸菌數量減少,這印證了青貯指標間的相關性分析結果,吳安琪[25]也得到了相似的結論。另外,pH抑制植物蛋白酶以及微生物酶的活性,降低了青貯過程中蛋白的降解,也可能是同型發酵乳酸菌植物乳桿菌149通過減少乙酸發酵,增加干物質損失來降低青貯中NH3-N/TN含量,這與Ellis等[11]研究結果一致。本研究中,所有處理燕麥青貯均未檢測到BA含量,究其原因可能是青貯中乳酸菌的增殖,抑制了不良微生物的發酵,從而降低了BA的含量,這與張玉琳等[26]研究結果相似。

隨著留茬高度的增加,倒伏燕麥青貯pH,LA,PA下降,AA含量上升,其中JH4處理青貯pH,PA含量顯著低于其他處理,這可能是因為留茬高度越高,燕麥倒伏后與土壤接觸的面積減少,促進青貯發酵,說明留茬高度可以改善倒伏燕麥青貯發酵品質。青貯NH3-N/TN含量隨留茬高度的增加無顯著變化,這與郝陽毅等[27]研究結果相一致,因此,留茬高度對倒伏燕麥青貯蛋白質降解沒有影響。綜上所述,倒伏燕麥青貯品質與留茬高度密切相關,且接種復合乳酸菌也會顯著影響倒伏燕麥青貯品質。

3.4 倒伏燕麥青貯品質綜合評價

采用隸屬函數和主成分分析相結合的方法對倒伏燕麥青貯品質進行綜合評價。但是,各指標間計量單位和數據量綱不同,利用隸屬函數法對原始數據進行標準化,增強結果的準備性[28]。主成分分析通過降維將多個指標轉化為包含80%以上信息的幾個綜合指標進行綜合評價[29]。本研究發現,第1主成分的方差貢獻率(54.86%)最大,主要反映的指標為pH,NH3-N/TN、干物質損失、PA、WSC,說明是倒伏燕麥青貯品質評價中最重要的影響因子,第2主成分主要反映的是NDF、ADF,第3主成分主要反映的是CP,AA。綜合評價結果表明,JH4處理青貯品質最佳,其綜合得分為1.11,這與JH4處理營養品質和發酵品質相對較好相互印證,說明隸屬函數和主成分分析評價方法避免了單一指標評價倒伏燕麥青貯品質的片面性。

4 結論

燕麥倒伏后減少其刈割貼土壤部分植株,可降低腐壞植株及土壤卷入對燕麥青貯品質造成的負面影響。加入適宜的乳酸菌菌劑,可提高倒伏后的燕麥青貯中的發酵品質。通過隸屬函數和主成分分析進行綜合評價發現,成都地區采用“接種復合乳酸菌+留茬高度為45 cm”方式可改善倒伏燕麥青貯品質。