不同添加劑對中藥渣青貯品質的影響

詹佳琦,陳丹丹,郭田心,郭 香,吳 碩,陳曉陽,周 瑋,張 慶

(華南農業大學林學與風景園林學院,廣東木本飼料工程技術研究中心,廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室,亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室,廣東 廣州 510642)

隨著中醫業的迅猛發展,中藥渣作為提取中草藥原料所遺留的下腳料,在中成藥、中藥飲品及含中藥成分的日化產品日益增加的同時其產量也逐漸增加。目前,我國中藥與天然藥用生物資源的種植面積已經超過了240萬hm2,每年中藥渣產量高達1 200萬t[1]。然而無論是中藥飲品還是醫療使用的各類藥材,亦或是食療等產生的中藥廢渣均沒有得到合理的利用。常見的處理中藥渣的方式主要有填埋、焚燒、堆放等,這些處理方式不僅占用土地,導致環境污染,還會造成資源浪費[1]。隨著可持續發展的觀念深入人心,如何有效利用中藥渣引起了人們的廣泛關注。在積極尋找中藥渣綠色處理方式的同時,我國畜牧業在發展過程中因受多種因素制約所引起的飼料短缺問題也引起了人們的注意,其中優質牧草供應不足是現階段制約我國畜牧業發展的主要因素之一[2-3]。隨著農業結構側改革的進行且在我國飼料資源不足的現象日益凸顯的情況下,畜牧行業需要進一步開發新型飼料,其中將經處理后的中藥渣加工調制成非常規飼料可能是有效解決飼料短缺、促進廢棄物回收循環利用的方法之一。

劉瑜彬等的研究表明[4],中藥渣作為發酵原料發酵后,不僅具有較高的營養價值,且具有一定的藥學功能,其可以作為飼料原料或功能性添加劑。朱彤等[5]用含中藥渣的發酵飼料飼喂畜禽后發現,中藥渣的添加可以提高飼料轉化率,改善畜禽產品品質,促進豬只生長,同時在減少不同豬群糞污的排泄量和環境污染等方面有著獨特的作用。李華磊等[6]在用“十全大補”發酵中藥渣對48頭21日齡仔豬進行飼用安全性試驗的研究表明,在提高斷奶仔豬生長性能及其抗氧化力、降低腹瀉率、提高其機體體液免疫方面,中藥渣有著獨特的積極作用。目前,中藥渣利用率普遍較低,主要是由于植物源中藥中存在植物細胞壁,其中大量的活性營養成分不易被動物利用,因此合理的對中藥渣進行生物發酵、添加劑處理,不僅能夠破壞中草渣的細胞壁、降解纖維素、促進動物的營養吸收,還能夠有效的減少中藥渣的毒副作用[7]。纖維素酶(Cellulase,CE)是一種能夠專一性降解纖維素的高活性生物催化劑[8]。在青貯中添加纖維素酶可以使結構性碳水化合物更易被水解利用,從而有效地縮短厭氧發酵周期、促進乳酸發酵[9-10]。果膠酶(Pectase,PE),是一類能夠有效分解果膠質的酶,生產飼料時,堿性果膠酶能夠與纖維素酶、半纖維素酶混合,降解植物細胞壁中的果膠和纖維,同時釋放出淀粉、蛋白質、維生素等物質,進而提高飼料的營養價值。此外,在飼料中添加堿性果膠酶,還可以調整飼料黏度,從而使動物對飼料的營養物質吸收效果提升[11]。木聚糖酶(Xylanase,XY)可以使木聚糖類半纖維素降解為低聚糖與木糖,將青貯原料細胞壁的表面結構打破,令纖維素網狀結構變得松散,比表面積增大,從而使飼料更易被瘤胃微生物附著與分解,進而提高飼料的消化率[12]。Desta等人[13]在象草(Pennisetumpurpureum)的青貯試驗中添加了木聚糖酶,結果發現青貯過程中水溶性碳水化合物含量和乳酸含量增加,半纖維素的含量降低。

綜上所述,本試驗將通過在中藥渣中添加不同濃度葡萄糖(Glucose,G)和纖維素降解相關酶制劑,以直接或間接的方式供應中藥渣青貯過程中充分的發酵底物(可溶性糖碳水化合物),此外在酶類降解反應過程中輔佐以添加產酸能力強的植物乳桿菌菌株加速發酵進程,嘗試改善中藥渣青貯品質,以期為中藥渣青貯品質改善的技術提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗在佛山某中藥飲品加工企業收集得到廢棄中藥渣,分別命名為中藥渣1[黃芪(AstragaliRadix)、山藥(DioscoreaRhizoma)與茯苓(Poria)混合中藥渣]與中藥渣2[柴胡(BupleurumchinensisDC)]。兩組中藥渣均分別添加不同濃度葡萄糖(G);植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,LP)與不同的酶(E)組合進行34天的青貯,其中酶共3種,分別為纖維素酶(E1)、果膠酶(E2)和木聚糖酶(E3)(酶均產自湖南盛東生物科技有限公司,纖維素酶的酶活為2×104U·g-1,果膠酶活為3×104U·g-1,木聚糖酶的酶活為2×105U·g-1)。

本試驗所用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,LP)為辣木葉(Moringaoleifera,M)青貯飼料中分離并鑒定出的菌株。2019年5月在華南農業大學啟林北試驗田人工采集辣木葉后,立刻帶回實驗室進行切碎并混合均勻,按照試驗設計分裝至聚乙烯塑料袋(20 cm×30 cm)中,每袋約200 g,真空封口機抽真空并密封保存。經過60 d青貯發酵后開袋取樣并進行梯度稀釋MRS瓊脂培養基選擇培養后分離出96株乳酸菌菌株,從中挑選出的植物乳桿菌菌株,培養24小時后產酸能力較強(pH=3.8)[14]。

1.2 試驗設計

試驗一研究不同濃度的葡萄糖對不同中藥渣青貯品質的影響,設對照組CK,試驗組分別為0.5%G(0.5 g葡萄糖與100 mL蒸餾水混合均勻后,均勻噴灑到200 g中藥渣當中)、1%G(1 g葡萄糖與100 mL蒸餾水混合均勻后,均勻噴灑到200 g中藥渣當中)。

試驗二研究植物乳桿菌和酶制劑對不同中藥渣青貯品質的影響,設對照組CK,試驗組分別為植物乳桿菌+纖維素酶(LP+E1)、植物乳桿菌+果膠酶(LP+E2)、植物乳桿菌+木聚糖酶(LP+E3),各組中藥渣用量同樣為200 g。其中CK為空白對照組,添加等量的純水混勻;LP添加量是106cfu·g-1,酶添加劑的添加量均為200 U·g-1。

1.3 試驗指標測定

本試驗所涉及指標的測定方法均參照王成等[15]的研究,并在其方法上做適當的修改及補充。

中藥渣青貯料混合均勻后取出約70.0 g放置于信封袋中,65℃條件下烘2天至恒重,根據記錄的烘前烘后樣本重量,計算干物質含量[16]。采用蒽酮比色法測定水溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrate,WSC)含量[17]。

準確稱取10.0 g中藥渣青貯樣品與90 mL的蒸餾水混合均勻,放置于4℃冰箱中過夜浸取,搖床震蕩1 min后利用定性濾紙過濾,采用雷磁pHS-3C型pH計測定濾液的pH值[18]。將測定pH值后的濾液用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾后,再采用島津GC-14型高效液相色譜儀(色譜柱:Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column,日本。檢測器:SPD-M10AVP)測定有機酸[乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)]的含量[19]。根據苯酚-次氯酸鈉比色法[21],配制以絕干(NH4)2SO4為標準品的標準銨溶液,并制作標準曲線,經預試驗后,向適量樣品浸提液加入5 mL苯酚溶液和4 mL次氯酸鈉溶液,置于95℃恒溫水浴鍋中反應5 min,冷卻后于630 nm波長下測OD值,計算得出氨態氮(NH3-N)含量。

將20.0 g青貯樣品與180 mL無菌生理鹽水充分振蕩后逐級稀釋。30℃條件下用MRS瓊脂培養基和結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基分別培養乳酸菌和大腸桿菌48 h;28℃條件下用孟加拉紅培養基培養酵母菌和霉菌48 h。平板計數法測定微生物數量[19-20]。本試驗培養基均購自廣州鼎國生物技術有限公司。

稱取0.5 g中藥渣青貯后干粉,加入濃硫酸和催化劑(硫酸鉀∶硫酸銅,5∶1)消煮完成后,用凱氏定氮儀(FOSS Kjeltec 8400,丹麥)測定粗蛋白質含量[22]。根據范氏纖維法[23],使用纖維分析儀測定酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)的含量。

1.4 數據統計

采用SPSS 19.0進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA),兩個因素互作時用Duncan法對各組進行多重比較,P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 青貯前中藥渣的特性

中藥渣1和中藥渣2的干物質含量差異較小(約為32.57%和35.88%)(表1),中藥渣1的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量比中藥渣2高。中藥渣1和中藥渣2的可溶性碳水化合物含量分別是8.79%DM和10.87%DM;粗蛋白含量分別是11.75%DM和10.36%DM。中藥渣1和2表面附著的乳酸菌、酵母菌、霉菌和大腸桿菌數量均小于2. 00 lg cfu·g-1FM。

表1 中藥渣原料青貯前的特性(±SD,n=3)Table 1 Characteristics of traditional Chinese medicine residues before silage (±SD,n=3)

2.2 添加葡萄糖對中藥渣青貯品質和營養價值的影響

由表2可知,不同濃度的葡萄糖添加到兩類中藥渣中后降低了青貯飼料的pH值(P<0.01),僅在0.5%G添加處理的中藥渣2青貯飼料中作用不明顯。0.5%G處理顯著增加了中藥渣1的干物質含量(P<0.05)。添加0.5%G對不同中藥渣乳酸菌計數的變化不同,中藥渣1中乳酸菌含量顯著降低(P<0.05),而中藥渣2的乳酸菌含量卻顯著增加(P<0.05)。在中藥渣1發酵飼料中,僅在添加1%G處理組中檢出酵母菌。添加0.5%G處理后,中藥渣2中酵母菌含量顯著增加(P<0.05)。此外中藥渣1添加0.5%G后乳酸和乙酸含量顯著增加(P<0.05),中藥渣2添加1%G后,乳酸和乙酸含量顯著下降(P<0.05)。與對照相比,中藥渣2用1%G處理后,可溶性碳水化合物含量顯著增加(P<0.05)。此外,當中藥渣所包含的種類不同時,其干物質含量具有顯著差異(P<0.05),中藥渣種類對pH值、可溶性碳水化合物及粗蛋白含量也有極顯著影響(P<0.01)。不同的添加劑處理與中藥渣種類的交互作用對乳酸菌、乙酸及可溶性碳水化合物含量具有極顯著影響(P<0.01),對乳酸含量有顯著影響(P<0.05)。

表2 添加葡萄糖對中藥渣1和2青貯品質和營養價值的影響Table 2 Effects of adding glucose on the silage quality and nutritional value of chinese medicine residue 1 and 2

2.3 添加LP和不同酶對中藥渣1和中藥渣2青貯品質和營養價值的影響

由表3可知,LP與酶制劑混合處理后兩種中藥渣中的干物質含量并沒有發生明顯變化,但它們顯著降低了pH值(P<0.05)。LP+PE處理后兩種中藥渣中的乳酸菌顯著減少。所有的處理中均未檢測到霉菌和大腸桿菌,僅在LP+CE處理的中藥渣2中檢測到酵母菌。LP與不同酶制劑的混合處理均降低了兩種中藥渣的氨態氮、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量(P<0.05)。與對照相比,LP+CE處理后的中藥渣1酸性洗滌纖維含量顯著下降(P<0.05),LP+CE和LP+PE處理后的中藥渣1中的中性洗滌纖維含量顯著下降。雖然相較于對照組,除了LP+CE處理顯著增加了中藥渣1的粗蛋白含量以外(P<0.05),其他試驗組中粗蛋白含量并沒有明顯變化,但添加劑處理對兩種中藥渣的粗蛋白含量影響極顯著(P<0.01)。

表3 添加LP和不同酶對中藥渣1和2青貯品質和營養價值的影響Table 3 Effects of adding lp and different enzymes on the silage quality and nutritional value of chinese medicine residues 1 and 2

3 討論

3.1 中藥渣原料特點

依據Jessie等[24]的報道,飼草的干物質含量在30%～35%之間是達到良好青貯發酵效果的指標之一。兩種中藥渣的干物質含量達到了理想發酵的要求。中藥多為植物,絕大多數纖維含量高,根據黎智華等[25]的研究發現,適宜的纖維含量有利于促進動物消化道發育、刺激胃腸蠕動及分泌消化液,還可以緩解有害物質對動物腸黏膜的損傷,但纖維含量過高會降低飼料的適口性,同時影響營養物質的吸收利用。NDF或ADF作為粗纖維中的主要成分,它們是保證奶牛瘤胃正常發酵的重要指標[26]。與王春梅等[27]的研究結果相比,本研究中藥渣原料的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量相對較高。利用參與纖維素降解相關的酶類對中藥渣進行發酵前期的預處理,不僅可以使得植物細胞內的營養成分得到有效釋放促進反芻動物對此類非常規飼料中營養物質的吸收,被降解的纖維素還能轉化為反芻動物可利用的可溶性碳水化合物,厭氧條件下為乳酸菌提供充分的發酵底物、加速發酵進程[28]。當前的研究中由于中藥渣的纖維素含量較高,即使其WSC含量能滿足良好發酵的基本要求(>38 g·kg-1),也無法確保乳酸菌能夠有效的利用[29]。此外中藥渣表面附著的乳酸菌數量較低(<5 lg cfu·g-1),這都無法確保中藥渣在青貯過程中穩定發酵,致使營養物質無法獲得良好保存,因此需要有效的添加劑來促進中藥渣青貯飼料發酵過程中乳酸菌的發酵并減少營養損失。

3.2 添加葡萄糖中藥渣青貯品質和營養價值

pH值是衡量青貯飼料品質的重要指標。一般認為青貯飼料pH值低于4.2時,腐敗微生物能被抑制,青貯飼料能得到良好的發酵效果。但pH值過低不利于有益菌的生存[19]。根據何立貴[30]給出的pH值與青貯質量之間的關系標準,可知pH值在3.5～4.1范圍內最有利于青貯品質。在本試驗中所有處理組的pH值均低于4.2,這可能是中藥渣青貯后不良微生物(大腸桿菌、霉菌)的生長受到明顯抑制,達到良好抑菌效果的原因。張濤等[31]及趙慶杰等[32]的研究表明,乳酸菌可以降低pH值及蛋白質的分解,減少干物質損失,從而獲得優質的青貯飼料。在中藥渣青貯發酵過程中乳酸菌是優勢菌種,添加0.5%G更加增長了中藥渣2中乳酸菌的生長活性。但根據Ohmomo等[33]的報道,許多乳酸菌菌株在pH值低于4.0的環境下時耐受性較弱,本試驗中各處理組pH值均低于4.0,且添加了不同濃度的葡萄糖后中藥渣的pH值降低,這可能是0.5%G處理的中藥渣1中乳酸菌數量下降的原因。整個青貯發酵期間,無論是否添加0.5%的葡萄糖,中藥渣1中均未檢測出酵母菌,可能是因為中藥渣1中具有抑制其生長的活性成分,但是添加1%G后,酵母菌的生長在中藥渣1中明顯增加,這可能是因為充分的發酵底物給酵母菌的生長提供了所需養分,使得酵母菌在發酵初期正常生長,同時,在中藥渣2中添加0.5%的葡萄糖后,可能已達到了酵母菌生長所需的最適發酵底物需求,因此其數量顯著增加(P<0.05)。氨態氮含量能反映蛋白的降解速率,當粗蛋白被轉化成氨態氮以后,并不能被反芻動物有效利用,而是大部分被微生物轉化成菌體蛋白,氨態氮含量越高,意味著蛋白營養損失越嚴重[34]。盡管在當前的研究中,添加葡萄糖以后,并沒有顯著減少氨態氮含量,但與對照組相比,所有處理組氨態氮的含量均有所下降。

3.3 添加LP和不同酶青貯34天后的發酵中藥渣品質

pH值的變化解釋了不良微生物的生長情況。青貯34天以后,在中藥渣青貯飼料中均未檢測到大腸桿菌、酵母菌、霉菌的存在,這可能是因為較強的酸性條件抑制了其生長活性。纖維含量是評價粗飼料品質最主要的指標之一,中藥渣在添加LP與不同酶組合的青貯添加劑后,酸洗洗滌纖維和中性洗滌纖維含量顯著減少(P<0.05),這可能是由于酶制劑有效地將纖維素降解成了微生物可直接利用的單糖,加速了乳酸菌發酵進程,產生大量的有機酸,這個變化規律與pH值的變化也是一致的[35]。此外,添加LP與不同酶的組合后,中藥渣粗蛋白含量增加同時減少了氨態氮的產生。

4 結論

由本試驗可知添加不同濃度的葡萄糖能有效降低中藥渣青貯飼料的pH值,添加植物乳桿菌與纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶的不同組合對于降低中藥渣青貯飼料的pH值、減少蛋白降解及降低中藥渣纖維素含量等具有良好效果,中藥渣作為非常規飼料開發具有較大可行性。