基于UCP2信號研究丙泊酚對腦缺血/再灌注大鼠小膠質細胞極化的影響

肖志博 符少川 謝海 金輝 葛樹勝

(海南醫學院第一附屬醫院麻醉科,海南 ?？?570102)

心腦手術期間的腦缺血/再灌注(I/R)損傷嚴重影響了患者的預后,迫切需要更多的防治策略。丙泊酚預處理已在離體與在體實驗中被證實對I/R損傷具有明顯保護作用〔1〕。然而,這種神經保護作用的分子和亞細胞機制仍不清楚。炎癥反應是I/R 損傷的病理特征之一,小膠質細胞是大腦組織中的巨噬細胞,具有在I/R期間介導炎癥反應的特性。抑制促炎表型小膠質細胞(M1)極化,促進抗炎表型小膠質細胞(M2)極化,能夠有效減少炎癥反應,促進神經元新生,重塑神經元回路〔2〕,這可能是I/R損傷中發揮神經保護作用的亞細胞機制。

解耦聯蛋白(UCP)2是線粒體內膜蛋白。以往研究顯示,UCP2通過調控活性氧(ROS)發揮免疫防御作用〔3〕。丙泊酚很早就被發現可以提高UCP2轉錄,維持線粒體活性,發揮對I/R保護作用〔4〕。近年研究顯示UCP2 缺乏會造成抗氧化作用抑制,促進炎性細胞因子釋放,從而增強腦 I/R 損傷〔5〕。然而,丙泊酚發揮抗I/R損傷作用是否與UCP2調控相關,且UCP2對I/R過程中小膠質細胞極化的作用機制尚不清楚。本研究擬探究丙泊酚對I/R大鼠腦組織中UCP2表達和小膠質細胞極化的影響,以期為臨床上改善I/R損傷提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 60只清潔級SD雄性大鼠,7周齡,體質量200～230 g,由海南藥物研究所有限責任公司提供〔SCXK(瓊)2020-0007〕。所有大鼠飼養于海南醫學院動物實驗中心〔SYXK(瓊)2017-0003〕。飼養條件:溫度(24±1)℃,濕度(60±5)%,噪音≤80 dB,12 h/12 h循環光照。本實驗經海南醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準,實驗動物操作均遵循3R原則。大鼠入組1 w后,隨機分為假手術組,模型組,丙泊酚低劑量組,丙泊酚中劑量組,丙泊酚高劑量組,丙泊酚劑量分別為5、15、25 mg/kg,每組12只。

1.2實驗試劑與儀器 丙泊酚(規格:200 mg/20 ml,四川國瑞藥業有限責任公司,批號:XLH057),腦卒中線栓(型號:L3200,廣州佳靈生物技術公司),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,北京索萊寶生物公司,批號:sc287436),Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司,批號:1002-8743);逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司,批號:1005-2943);熒光定量PCR試劑盒(美國Invitrogen公司,批號:1003-4832);PCR引物(廣州銳博生物公司);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(杭州聯科生物公司,批號:849322、489328、493221、109438);離子鈣結合接頭分子(iba)1抗體(美國abcam公司,批號:ab1843);UCP2抗體、p-核轉錄因子(NF)-κB抗體、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白(NLRP)3抗體、β-actin抗體(北京博奧森生物公司,批號:bs4273、bs5437、bs3128、bs6373);辣根過氧化物酶(HRP)標記免疫球蛋白(Ig)G二抗(上海碧云天生物公司);酶標儀(Thermo,型號:Fc);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯生物公司,型號:CKX53);PCR檢測儀(美國BIO-RAD公司,型號:CFX384);化學發光成像儀(上海天能生物公司,型號:Tanon3500/300R)。

1.3I/R模型構建與實驗流程 參考文獻中Longa可逆性中動脈線栓法〔6〕構建腦卒中模型。所有大鼠禁食12 h后麻醉,仰臥位固定,沿頸部中線左側切開約1 cm傷口,暴露出左側頸動脈與頸內、頸外動脈。將線栓沿頸總動脈插入頸內動脈,前進至中動脈約16 mm。術中中動脈缺血后腹腔注射不同劑量丙泊酚溶液(5、15、25 mg/kg),模型組注射等體積的生理鹽水。中動脈缺血2 h后,緩慢拔出線栓,縫合傷口,放回籠中觀察。假手術組僅麻醉后分離左頸動脈,不做插線栓操作。24 h后,開展神經功能損傷評分,結束后將大鼠處死,取全腦組織用于TTC染色,免疫組化染色,取海馬組織用于炎性細胞因子檢測,PCR檢測和Western印跡檢測。

1.4神經功能損傷評分 參考文獻〔7〕中評分標準對所有大鼠開展神經功能評估;0分,正常;1分,輕微的轉彎行為,提尾時身體存在卷曲傾向,前肢無法完全伸展;2分,嚴重的轉彎行為,提尾時身體存在卷曲現象;3分,嚴重的轉彎行為,側推易倒,提尾時保持卷曲姿勢維持2 s以上;4分,失去行走或翻正反射;5分,昏迷或垂死;評分越高代表神經功能損傷越嚴重。

1.5腦梗死體積檢測(TTC染色) 取大鼠腦組織,冰箱中冷凍后切成6片,浸沒于2% TTC溶液中,37 ℃避光染色30 min,每5 min翻動一次切片。使用ImageJ軟件量化統計,計算白色梗死區域體積占大腦體積的比例(%)。

1.6腦脊液中炎性細胞因子檢測 通過大鼠枕骨大孔穿刺取腦脊液。將腦脊液1∶9稀釋后,在預包被抗IL-1β、抗IL-6、抗TNF-α或IL-10抗體的ELISA板中加入樣品,室溫反應2 h;根據說明書清洗樣品板,加入檢測抗體,室溫反應1.5 h;清洗樣品板,加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素,室溫反應30 min;清洗樣品板,加入顯色底物,避光反應5 min,加入反應終止液,在450 nm處檢測最大吸收波長。根據標準曲線計算各個樣品炎性細胞因子含量。

1.7大鼠腦皮層組織小膠質細胞活化檢測 預冷的生理鹽水心臟灌流,取腦組織用4%多聚甲醛固定,經梯度乙醇脫水、石蠟包埋后切為5 μmol/L冠狀切片。將切片置于微波爐中高溫烘烤20 min修復抗原,二甲苯脫蠟透化,置入3%甲醇雙氧水中孵育30 min,消除內源性過氧化物酶活性,37 ℃孵育1 h,隨后滴加iba1抗體,4 ℃濕盒中孵育過夜。次日,取出切片,加入HRP標記的二抗溶液,37 ℃反應2 h。使用二氨基聯苯胺(DAB)室溫顯色15 min,自來水沖洗,梯度乙醇脫水,樹膠封片。

1.8熒光定量PCR檢測小膠質細胞極化 取大鼠腦組織樣本,液氮中粉碎后,根據Trizol試劑盒說明書提取海馬組織總RNA,采用紫外吸收法對提取的總RNA樣本進行純度與濃度檢測。通過逆轉錄試劑盒制備cDNA,以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。條件:95 ℃ 預變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,60 ℃延伸30 s,40個循環;目的基因mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。引物序列(5′-3′):GAPDH上游:AACTTTGGCATTGTGGAAGG,下游GGATGCAGGGATGATGTTCT;CD16上游:TTTGGACACCCAGATGTTTCAG,下游GTCTTCCTTGAGCACCTGGATC;TNF-α上游:GCTGAGC TCAAACCCTGGTA,下游CGGACTCCGCAAAGTCT AAG;IL-1β上游:TGTGAAATGCCATTTGA,下游GGTCAAAGGTTTGGAAGCAG;一氧化氮合酶(iNOS)上游:CCCAGAGTTCCAGCTTCTGG,下游CC AAGCCCCTCACCATTATCT;CD206上游:CTTCGGG CCTTTGGAATAAT,下游CTTCGGGCCTTTGGAATAAT;TGF-β上游:TGCGCTTGCAGAGATTAAAA,下游CGTCAAAAGACAGCCACTCA;精氨酸酶(Arg)1上游:ACATTGGCTTGCGAGACGTA,下游ATCACCTTGCCAATCCCCAG;幾丁質酶3樣分子3(Ym1)上游:TGGAATTGGTGCCCCTACAA,下游GCATAGGGTACTTCCTGGGG。

1.9Western印跡法檢測腦皮層組織UCP2蛋白表達 取大鼠腦組織,加入RIPA裂解液勻漿,4 ℃離心12 000 r/min,20 min后取上清液,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液,煮沸10 min使蛋白變性;取上樣凝膠,每孔加入20 μg蛋白并開始電泳,電泳結束后半干法將凝膠蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;取PVDF膜以脫脂牛奶封閉,清洗后依次加入一抗抗體,4 ℃過夜,加入二抗稀釋液反應1 h;PVDF膜上滴加電化學發光(ECL)液顯色后,在化學發光成像儀下獲得各個蛋白條帶,以β-actin作為內參,通過灰度值計算各個蛋白相對表達量。

1.10統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、Dunnett-t檢驗。

2 結 果

2.1各組神經功能評分結果 假手術組神經功能沒有損傷,評分為0分;與假手術組相比,模型組神經功能評分顯著增加(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚中、高劑量組神經功能評分明顯減少(P<0.05)。見表1。

2.2各組腦梗死體積檢測結果 假手術組腦組織TTC染色顯示呈深紅色,即無梗死區域;與假手術組相比,構建I/R模型大鼠腦組織都出現了不同體積的白色區域;與模型組和丙泊酚低劑量組相比,丙泊酚中、高劑量組腦組織白色區域體積占比顯著減少(P<0.05)。見表1、圖1。

2.3各組腦脊液中炎性細胞因子檢測結果 與假手術組相比,模型組腦脊液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯增加(P<0.05),與模型組和丙泊酚低劑量組相比,丙泊酚中、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著減少,IL-10含量顯著增加;丙泊酚低劑量組TNF-α含量較模型組明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經功能評分、腦梗死體積、炎性細胞因子含量比較

圖1 各組腦梗死區域TTC染色

2.4各組腦皮層組織小膠質細胞活化比較 假手術組腦皮層細胞iba1染色密度較低;與假手術組相比,模型組腦皮層iba1染色密度明顯增加(P<0.05);與模型組和丙泊酚低劑量組相比,丙泊酚中、高劑量組腦皮層iba1染色密度顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2。

2.5各組腦皮層組織小膠質細胞極化標志物mRNA的比較 與假手術組相比,模型組腦組織M1型小膠質細胞標志物(CD16、TNF-α、IL-1β、iNOS)mRNA表達水平明顯增加(P<0.05),而M2型標志物(CD206、TGF-β、Arg1、Ym1)mRNA表達沒有明顯改變(P>0.05);與模型組和丙泊酚低劑量組相比,丙泊酚中、高劑量組M1型小膠質細胞標志物mRNA明顯減少(P<0.05),且M2型標志物mRNA明顯增加(P<0.05);丙泊酚低劑量組Ym1顯著高于模型組(P<0.05)。見表2、表3。

2.6各組腦組織中UCP2、NF-κB、NLRP3蛋白表達結果 與假手術組相比,模型組腦組織UCP2表達明顯減少(P<0.05),而p-NF-κB與NLRP3表達明顯增加(P<0.05);與模型組和丙泊酚低劑量組相比,丙泊酚中、高劑量組UCP2表達明顯增加(P<0.05),且p-NF-κB與NLRP3表達明顯減少(P<0.05)。見表3、圖3。

圖2 各組腦皮層組織iba1(DAB染色,大圖×200,小圖×1 000)

表2 各組iba1及CD16、TNF-α、IL-1β、iNOS mRNA含量比較

表3 各組CD206、TGF-β、aRG1、Ym1抗炎細胞因子mRNA含量及UCP2、NF-κB、NLRP3蛋白表達比較

1～5:假手術組、模型組、丙泊酚低劑量組、丙泊酚中劑量組、丙泊酚高劑量組圖3 各組UCP2、NF-κB、NLRP3蛋白表達

3 討 論

I/R損傷是一種復雜的生理病理過程,神經炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙等共同導致了缺血區神經元死亡,造成局部梗死。本研究顯示無論是否經歷丙泊酚治療,I/R模型大鼠腦組織都出現了局部梗死區域。與臨床CT診療中腦實質密度降低,呈片狀或斑片狀低密度影現象匹配〔8〕。腦組織作為機體活動的高級指揮中心,局部梗死必然會造成行為活動障礙,出現各種神經功能損傷。本研究中,神經功能評分顯示模型組大鼠右前肢無法完全伸展,僅能向一側轉圈,且側推易跌倒,甚至有半側癱瘓的現象。這些癥狀對應了臨床腦卒中患者預后常見的機體平衡能力弱,肢體行為遲緩甚至癱瘓的情況〔9〕。與此同時,以上結果與文獻中大鼠I/R模型癥狀一致〔10〕,因此本研究I/R損傷模型構建成功。

有研究〔11〕提示,炎癥反應是I/R損傷不可忽視的誘導途徑。丙泊酚是一種應用廣泛的短效靜脈麻醉藥,已有研究〔12〕證實,丙泊酚能夠調控炎癥反應,發揮保護作用,但該保護劑量基于不同模型,不同個體仍存在差異。Lv等〔13〕研究顯示,15 mg/kg丙泊酚即可降低miR-494 表達從而抑制肝缺血再灌注損傷,預防心肌細胞凋亡和改善心功能。在肺缺血再灌注損傷中,Zhang等〔14〕研究使用了18 mg/kg丙泊酚治療,結果顯示過量的自噬反應與炎癥因子釋放受到抑制。然而,對于腦損傷模型,可能由于血腦屏障存在的原因,多數研究中干預劑量都超過了20 mg/kg。Dai等〔15〕研究顯示,對于睡眠剝奪造成的大鼠學習與記憶能力損傷,30 mg/kg丙泊酚才能發揮抑制炎癥反應的作用。此外,Tao等〔16〕研究也有顯示,30 mg/kg丙泊酚對腦 I/R 損傷產生明顯保護作用,其機制可能與抑制凋亡誘導因子的核易位相關。綜合以上研究顯示,丙泊酚對外周缺血再灌注保護作用劑量可能為10～20 mg/kg,對腦缺血再灌注保護作用劑量可能為20～30 mg/kg。因此,本研究分別采用了5、15、25 mg/kg劑量進行了實驗研究。最終結果證實,丙泊酚劑量15 mg/kg與25 mg/kg才能減少腦梗死體積,提高神經功能,抑制炎癥反應,發揮抗I/R保護作用。

過度的炎癥反應是NF-κB/NLRP3信號誘導小膠質細胞活化結果〔17〕。小膠質細胞是中樞神經系統中與外周系統巨噬細胞功能相似的先天性免疫細胞,通常被認為是大腦的第一道防線。I/R損傷早期,為了清除外周侵襲的病原微生物與神經毒性物質,小膠質細胞活化后發揮吞噬作用〔18〕。此時,小膠質細胞主要極化為保護性抗炎M2表型。抗炎表型可以誘發包括神經發生、軸突重塑和髓鞘再生在內的多種機制修復受損組織〔19〕。不同的抗腦缺血藥物治療過程中都有發現抗炎性M2表型小膠質細胞的比例增加〔20〕。

隨著I/R損傷進展,小膠質細胞會動態地改變其表型和功能,逐漸轉變促炎性M1表型。促炎性小膠質細胞表型極化增加會加劇腦損傷,阻礙神經元新生,干擾腦卒中后神經功能修復〔21〕。本研究顯示,腦缺血組小膠質細胞活化,多表現為促炎性M1表型。丙泊酚干預下iba1表達明顯減少,小膠質細胞促炎性M1表型標志物降低,促炎性細胞因子釋放減少,且抗炎性M2表型增加。與此同時,IL-10作為一種抗炎因子,在丙泊酚誘導下釋放增加。以上結果提示,丙泊酚具有抑制I/R過程中小膠質細胞活化,提高小膠質細胞向M2表型極化的能力。

本研究進一步發現,小膠質細胞向促炎表型的極化會伴隨著UCP2表達降低。研究報道UCP2可以調節線粒體呼吸鏈能量和活性氧的產生,直接影響NF-κB磷酸化〔22〕。此外,UCP2-/-小鼠在脂多糖(LPS)刺激下會產生大量的氧化因子與促炎因子,且在此條件下NF-κB系統被激活〔23〕。NF-κB是由兩個DNA 結合亞基組成,在細胞質中與NF-κB抑制蛋白(IκB)結合,以無活性形式存在。部分刺激信號如活性氧、細胞色素C會導致IκB磷酸化,使IκB被泛素修飾與降解,從而使NF-κB二聚體移位至細胞核以調節靶基因表達〔24〕。NLRP3是NF-κB下游信號蛋白,在p-NF-κB的刺激下,募集凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和胱天蛋白酶-1前體(pro-caspase-1),導致caspase-1激活和細胞因子釋放,包括IL-1β和IL-18等。NLRP3炎癥小體激活會觸發小膠質細胞活化,誘導M1型的極化,并會加劇神經炎癥,提高腦缺血損傷〔25〕。因此,本結果中UCP2在模型組中表達降低會介導氧化因子等刺激因子含量升高,造成NF-κB磷酸化水平增加,導致下游NLRP3活化,導致小膠質細胞的活化,并誘導小膠質細胞向炎性表型的極化。然而,丙泊酚通過上調UCP2,調節了線粒體呼吸鏈電子傳遞,減少了活性氧的產生,從而抑制NF-κB的磷酸化,最終調節了小膠質細胞的活化與極化。

本研究采用中動脈栓塞構建I/R模型,模擬了臨床上急性腦卒中引起的不同程度腦組織缺血損傷,更接近臨床患者的病理生理,能夠用于臨床腦缺血損傷規律及藥物療效的等效評估。此外,本研究結果顯示,中/高劑量(15～25 mg/kg)丙泊酚可通過上調UCP2表達,抑制NF-κB的磷酸化,減少小膠質細胞的激活并調控小膠質細胞由M1型向M2型極化,降低炎性細胞因子的釋放,進而改善I/R大鼠神經功能損傷。通過等效劑量換算可以得出臨床上2.5～4.2 mg/kg丙泊酚能夠為缺血性腦卒中患者提供較好的保護作用。然而,本研究僅對I/R過程中丙泊酚干預下UCP2蛋白表達進行了檢測,未采用UCP2抑制劑或基因敲除動物模型開展研究,且對UCP2調控的氧化因子釋放,抗氧化因子的合成探究較少。