miR-124通過抑制TLR4/NF-κB/CCL2對腦梗死大鼠神經元凋亡的影響

陳笛 溫昌明 李祥欣 孫軍 高軍 張在行 張東煥 張保朝

(南陽市中心醫院,河南 南陽 473000)

腦梗死(CI)是一種多發于中老年人群的常見急性腦血管疾病,臨床上稱為缺血性腦卒中,發病急,可在短時間內引發序慣性腦損傷,嚴重損害神經功能,患者致死、致殘比例均較高〔1,2〕。CI起病急且病情進展快,往往錯過最佳治療窗口,臨床治愈率低,預后不佳,如今其患病人數逐年增加,已成為中老齡人群殘疾及死亡的主要原因〔3,4〕。腦缺血損傷發生時,因供血受阻引起缺血部位腦組織壞死,激活炎癥級聯反應,而血液再灌注時,會促進炎癥進展,進一步加重腦損傷,因而抑制神經炎癥是減輕缺血再灌注腦損傷、修復神經功能的有效手段〔5,6〕。Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB是機體調控細胞增殖、細胞外基質代謝、過氧化和炎癥反應的主要信號途徑〔7〕,抑制TLR4/NF-κB信號激活可降低炎性因子表達,增強抗氧化活性,減輕腦組織炎癥和氧化應激損傷,改善急性CI患者神經功能〔8〕。CC類趨化因子配體(CCL)2是TLR4/NF-κB途徑的下游信號因子,下調TLR4/NF-κB信號可降低CCL2的表達,抑制炎癥級聯反應,保護腦組織免于缺血損傷,因而TLR4/NF-κB/CCL2信號可作為CI的重要治療靶點〔9〕。微小RNA (miR)-124是介導阿爾茨海默病、創傷性腦損傷等神經系統疾病發生與進展的重要因子,過表達miR-124-3p可減輕重復性輕度創傷性腦損傷小鼠神經退行性病變,改善其認知功能〔10〕,并可減少膠質瘢痕的形成,促進CI恢復〔11〕,另有研究顯示,miR-124可通過下調TLR4/NF-κB/CCL2通路激活程度減輕高氧誘導的過度炎癥,抑制肺上皮細胞凋亡〔12〕。因而推測miR-124可能通過抑制TLR4/NF-κB/CCL2信號減輕腦缺血損傷所致的神經元凋亡,本文通過建立CI大鼠模型,對此進行探究。

1 材料與方法

1.1動物 SD大鼠,雄性,體質量200～230 g,SPF級,購于上海昇敞生物科技有限公司〔生產許可SCXK(滬)2021-0002〕。在南陽市中心醫院屏障環境動物房適應飼養,在動物籠中喂養,一籠5～6只,平均溫度(23±2.5)℃,平均濕度(55±5)%,照明12 h/12 h明暗循環交替,1 w后用于實驗。

1.2主要試劑及儀器 miR-124 agomir、TLR4過表達質粒、miR-124 agomir陰性對照、空載質粒、miR-124 與U6引物、一步法反轉錄熒光定量試劑盒(貨號B639277-0100)購于生工生物工程(上海)股份有限公司;大鼠白細胞介素(IL)-17酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號SEKR-0007)、三苯基氯化四氮唑(TTC,貨號T8170)、大鼠環氧化酶(COX)-2 ELISA試劑盒(SEKR-0075)、高效RIPA裂解液(貨號R0010)、總RNA提取試劑盒(貨號R1200)購于北京索萊寶科技有限公司;活性氧(ROS)測定試劑盒(貨號E004-1-1)、TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(貨號G001-1-1)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質定量檢測試劑盒(貨號C503021)購于南京建成生物工程研究所有限公司;兔源Anti-β-actin一抗(貨號ab8227)、兔源Anti-CCL2一抗(貨號ab7202)、兔源Anti-B淋巴細胞瘤-2蛋白(Bcl-2)一抗(貨號ab194583)、兔源Anti-增殖細胞核抗原(PCNA)一抗(貨號ab18197)、兔源Anti-NF-κB p65一抗(貨號ab16502)、兔源Anti-Bcl-2相關X蛋白(Bax)一抗(貨號ab32503)、兔源Anti-TLR4一抗(貨號ab214185)、羊抗兔二抗(貨號ab150077)購于美國Abcam公司等。

冰凍切片機、光學顯微鏡-型號CM1520、DMI3000B購于德國Leica公司;電泳儀、全段酶標儀、化學發光成像分析系統、實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀、轉膜儀-型號PowerPac Universal、1681135、ChemiDoc XRS+、CFX96 Touch 1855196、Trans-Blot Trubo,購于美國Bio-Rad公司等。

1.3制備CI大鼠模型及分組給藥 參照文獻〔13〕的方法制備大鼠CI模型:大鼠禁食12 h,禁水4 h,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉(質量分數2%)溶液,大鼠深度麻醉后仰臥固定在手術臺上,于頸部脫毛備皮、酒精消毒,切開頸部皮膚逐層分離肌肉組織,找到并游離左側頸總動脈、頸外動脈與頸內動脈,結扎頸外動脈后以特定線栓插入其中,經頸內動脈到達大腦中動脈,阻斷中動脈血流2 h,然后拔出線栓,恢復血流,再灌注24 h,即可完成造模。接著觀察大鼠行為,采用Zea Longa分級法〔14〕做神經功能缺損狀況評分:大鼠行為正常,0分;大鼠左前肢伸展不完全,1分;提尾大鼠時,其向左側轉圈,2分;大鼠行走不便,向左側傾倒,3分;大鼠不能行走,幾乎無意識,4分,評分1～3分表示建模成功,共成功造模60只。以隨機數表法將CI大鼠平均分為5組:模型組、miR-124 agomir組、TLR4過表達質粒組、miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組,另取12只大鼠只分離頸動脈,不做其他操作,作為假手術組。miR-124 agomir、TLR4過表達質粒、miR-124 agomir陰性對照、空載質粒濃度參照說明書設置,給藥處理組均于造模完成后,馬上以尾靜脈注射的方法干預給藥;模型組和假手術組尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液,各組均每周給藥1次,共給藥處理2 w。

1.4檢測神經功能 于造模完成2 w后觀察大鼠行為,按照1.3中的Zea Longa分級法對其神經功能缺損狀況進行評分。

1.5檢測CI情況及收集標本 神經功能缺損評分完成后,按照1.3中方法麻醉各組大鼠,抽取頸動脈血離心15 min(1 000 r/min,4 ℃),吸出上清分組標記后保存在-80 ℃;斷頭取出大腦,每組隨機選6只大鼠的大腦沿冠狀面切開后孵育TTC溶液,對其梗死部位進行染色,以多聚甲醛溶液固定后拍照,采用Image pro軟件分析圖片,計算CI面積=全腦梗死面積/全腦片面積×100%。各組剩余的6只大鼠大腦清洗后,各取0.4 g腦組織保存在液氮中;再次各取0.5 g腦組織制為勻漿液后離心20 min(3 000 r/min,4 ℃),以BCA試劑盒測量上清中總蛋白濃度,分組標記,保存在-80 ℃備用;剩余腦組織包埋、沉糖、速凍(液氮,1 min)成塊、切片備用。

1.6檢測海馬神經元凋亡情況 取1.5中腦組織切片,選出其中具有完整海馬結構的,浸入預冷的丙酮中固定,TUNEL染色,顯微鏡下觀察,選任意3個視野拍照,以Image pro軟件分析圖片,計算神經元凋亡率=凋亡神經元細胞數/總細胞數×100%。

1.7檢測血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平 取1.5中血清,經冰水浴解凍后,以試劑盒測定其中ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平,具體步驟依照說明書指導進行。

1.8檢測腦組織miR-124表達 取1.5中保存在液氮中的腦組織塊,以試劑盒提取其中總RNA后,進行一步法反轉錄熒光定量PCR擴增實驗,具體步驟與反應條件設定依照說明書指導進行,miR-124的內參基因選擇U6,采用2-ΔΔCt算法對數據進行分析后得到其相對表達量,引物序列:miR-124正向5′-GCGCTGGAGGAGAAGGAAG-3′,反向5′-GCTGTCAACGATACGCTACG-3′;U6正向5′-CGCTTCGGCA GCACATATAC-3′,反向5′-AAATATGGAACGCTTC ACGA-3′。

1.9檢測大鼠腦組織凋亡與TLR4/NF-κB/CCL2通路相關蛋白表達 取1.5中的各組腦組織蛋白樣品液,經冰水浴解凍后各取20 μg蛋白,經變性,上樣,電泳,濕轉,可將其按分子量大小于硝酸纖維素膜上分離開,然后封閉其非特異位點,孵育一抗(Bcl-2、Bax、β-actin、TLR4、NF-κB、PCNA、CCL2),孵育二抗,顯影,拍照,以Image pro軟件分析蛋白圖片,對其灰度值進行定量后統計分析,最終得到各組蛋白相對表達量。

1.10統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組神經功能缺損情況檢測 與假手術組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組分別比較,miR-124 agomir組神經功能缺損評分均顯著降低(P<0.05),TLR4過表達質粒組神經功能缺損評分均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組神經功能缺損評分無顯著變化(P>0.05)。見表1。

2.2各組血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平的檢測結果 與假手術組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組分別比較,miR-124 agomir組血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平均顯著降低(P<0.05),TLR4過表達質粒組血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組大鼠血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平無顯著變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經功能缺損評分、血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平比較

2.3各組CI情況的檢測結果 與假手術組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組CI面積顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組分別比較,miR-124 agomir組CI面積均顯著降低(P<0.05),TLR4過表達質粒組CI面積均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組CI面積無顯著變化(P>0.05)。見圖1、表2。

2.4各組腦組織miR-124與凋亡蛋白表達水平的檢測 與假手術組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組大鼠腦組織miR-124 mRNA與Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組分別比較,miR-124 agomir組腦組織miR-124與Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05),Bax表達水平均顯著降低(P<0.05),而TLR4過表達質粒組腦組織miR-124與Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05),Bax表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組大鼠腦組織miR-124與Bcl-2、Bax蛋白表達水平無顯著變化(P>0.05)。見表2、圖2。

1～6:假手術組、模型組、miR-124 agomir組、TLR4過表達質粒組、miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組;圖2～4同圖1 TTC染色觀察各組CI情況

表2 各組CI面積及腦組織miR-124與凋亡蛋白相對表達比較

圖2 Western印跡檢測各組腦組織凋亡蛋白表達

2.5各組海馬神經元凋亡率的檢測 與假手術組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組海馬神經元凋亡率顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組分別比較,miR-124 agomir組海馬神經元凋亡率均顯著降低(P<0.05),TLR4過表達質粒組海馬神經元凋亡率均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組大鼠海馬神經元凋亡率無顯著變化(P>0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組海馬神經元凋亡(TUNEL染色,×200)

2.6各組腦組織TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白表達的檢測 與假手術組比較,模型組、miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組腦組織TLR4、核內NF-κB p65、CCL2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-124 agomir+TLR4過表達質粒組分別比較,miR-124 agomir組腦組織TLR4、核內NF-κB p65、CCL2通路蛋白均顯著降低(P<0.05),TLR4過表達質粒組大鼠腦組織TLR4、核內NF-κB p65、CCL2通路蛋白均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124 agomir陰性對照+空載質粒組腦組織TLR4、核內NF-κB p65、CCL2蛋白表達水平無顯著變化(P>0.05)。見表3、圖4。

表3 各組凋亡率及腦組織TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白相對表達比較

圖4 Western印跡檢測各組腦組織TLR4/NF-κB/ CCL2通路蛋白表達

3 討 論

本文采用線栓閉塞大腦中動脈法建立CI大鼠模型,結果顯示,造模大鼠CI面積、血清ROS及炎癥因子COX-2、IL-17水平顯著升高,引發強烈的腦組織炎癥,導致腦組織抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低,促凋亡蛋白Bax表達顯著增加,引起海馬神經元大量凋亡,造成神經功能缺損,揭示CI模型建立成功。

CI患者腦組織的缺血缺氧及血液再灌注均會顯著增強促炎細胞因子表達,降低抗炎細胞因子表達,激活炎癥級聯反應并促進其進展,進而導致嚴重的腦損傷,抗炎治療是減輕CI臨床癥狀的有效方法〔6,15〕。TLR4是重要的炎癥調節分子,可通過激活NF-κB信號,促進CCL2表達,參與介導結腸炎、變應性鼻炎、抑郁等炎癥相關疾病的發病過程,下調TLR4/NF-κB信號通路表達可減少炎性因子表達及炎癥細胞數量,有效減輕結腸炎癥及變應性鼻炎小鼠癥狀〔16,17〕,并抑制急性CI患者腦組織炎癥,進而改善患者神經功能損傷〔8〕。抑制TLR4/NF-κB信號還可下調CCL2表達,抑制炎癥級聯反應激活,減輕神經炎癥,緩解腦缺血損傷〔9,18〕。由此可知,TLR4/NF-κB/CCL2信號是CI的重要治療靶點。miR-124是一種重要的神經保護因子,可顯著減少腦缺血后梗死面積,減輕缺血性腦損傷并促進神經元存活〔19〕,并可改善腦卒中后的腦組織修復〔11〕。研究顯示,miR-124可調控TLR4信號傳導,可通過抑制TLR4/NF-κB/CCL2信號激活進而增強抗炎介質表達,阻止炎癥進展〔12,20〕。因此推測抑制TLR4/NF-κB/CCL2信號可能是miR-124改善CI腦損傷的分子機制。本文結果顯示,CI模型大鼠腦組織miR-124表達水平顯著降低,TLR4、NF-κB p65、CCL2蛋白表達水平顯著升高。以miR-124 agomir上調CI模型大鼠miR-124表達,可降低其腦組織Bax、TLR4、核內NF-κB p65、CCL2蛋白表達,降低CI面積,減少活性氧及促炎因子合成釋放,抑制腦組織炎癥,減輕海馬神經元凋亡及神經功能缺損癥狀。而以TLR4過表達質粒上調CI模型大鼠TLR4表達,起到相反作用,與miR-124 agomir合用可減弱過表達miR-124抑制CI大鼠腦組織炎癥及海馬神經元凋亡的功效,逆轉其對大鼠神經功能缺損的修復作用,表明miR-124可通過抑制TLR4/NF-κB/CCL2信號減輕CI大鼠腦損傷,修復其神經功能。

綜上所述,miR-124可通過下調TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白表達,減少炎性細胞因子及活性氧的產生釋放,阻止炎癥級聯反應激活,抑制CI大鼠海馬神經元細胞凋亡,減輕腦組織損傷,改善CI癥狀,修復其神經功能,表明miR-124因子具有較強的腦保護活性,抑制TLR4/NF-κB/CCL2激活是其分子機制之一。本文為CI的發病機制的探明做出了一定貢獻,提供了新的治療靶點,后續會對miR-124調控TLR4/NF-κB/CCL2信號的具體作用機制做更深入全面的研究。