基于AMPK/sirt1/RANKL/OPG通路研究補陽還五湯促進骨質疏松性骨折大鼠愈合的機制

林玉玲 李杰玉 李增一 劉琳 籍胤璽 金毅

(南陽市中心醫(yī)院,河南 南陽 473000)

骨質疏松是一種與衰老密切相關的病理現象,臨床以骨量減少、骨組織結構退化為特征,導致骨的脆性增加,增加骨折風險〔1,2〕。目前有關其治療主要是通過手術、手法整復聯合抗骨質疏松治療,缺少骨質疏松骨折患者針對性治療藥物,而中藥治療骨質疏松歷史悠久,療效肯定,許多中醫(yī)方劑被證實既可改善骨質疏松,還可促進骨折愈合〔3,4〕。補陽還五湯是經典的中醫(yī)方劑,記載于清代王清任的《醫(yī)林改錯》,近年來,臨床上常用于治療骨質疏松〔5,6〕。向興彤等〔7〕研究發(fā)現,補陽還五湯可促進老年患者骨折愈合。本實驗探究補陽還五湯防治骨質疏松性骨折的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD雌性大鼠,體質量280～320 g,購自河北中醫(yī)學院,許可證號:SYXK(冀)2017-005。動物均被飼養(yǎng)在25 ℃恒溫、50%恒定濕度的房間里。大鼠實驗程序均按照本院動物護理和使用委員會的指導方針進行。手術程序和術后實驗程序均經醫(yī)院動物護理和使用委員會批準。

1.2實驗試劑 補陽還五湯是由黃芪、當歸、赤芍、地龍、桃仁、紅花、川芎按120∶6∶4∶3∶3∶3∶3∶3∶3的比例配制而成的顆粒,批準文號:國藥準字Z44020711,購自華潤三九藥業(yè)有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒,貨號:A001,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒,貨號:A005,丙二醛(MDA)測定試劑盒,貨號:A003,均購自南京建成生物工程研究所。AMP活化蛋白激酶(AMPK,ab32047)、沉默信息調節(jié)因子(sirt)1(ab189494)、核轉錄因子(NF)-κB受體活化蛋白配體(RANKL)(ab169966)、骨保護素(OPG,ab203061)抗體購自美國Abcam公司。

1.3主要儀器 Ultra Focus雙能X射線小動物骨密度(BMD)儀購自美國Faxitron公司。自動生化分析儀購自美國Beckman Coulter公司。光學顯微鏡購自日本Olympus公司。熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀、蛋白電泳儀和轉膜儀購自美國Bio-Rad公司。Odyssey成像系統(tǒng)購自美國LI-COR Biosciences公司。

1.4大鼠骨質疏松骨折模型的制備 骨質疏松模型〔8〕:大鼠造模前適應性飼養(yǎng)1 w后,將大鼠麻醉,切開腹部皮膚,摘除大鼠雙側卵巢,假手術組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。6 w后,用小動物BMD儀檢測大鼠右股骨BMD值〔9〕,模型組和藥物處理組股骨BMD值顯著低于假手術組即為骨質疏松模型制備成功。骨折模型:骨質疏松造模成功后制備骨折模型。首先將大鼠用10%水合氯醛麻醉,取右下肢股骨外側切口,顯露股骨干,線鋸橫行鋸斷右股骨,然后使用直徑為1 mm的克氏針固定,消毒縫合切口皮膚。

1.5動物分組及給藥 將大鼠隨機分成假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組和補陽還五湯高劑量組,每組12只。除假手術組外,其余組均切除雙側卵巢造成骨質疏松性骨折模型。造模成功后,根據人與實驗動物用藥劑量換算,分別給予補陽還五湯低、中、高劑量組以6.25、12.50、25.00 g/kg的劑量灌胃給藥。假手術組和模型組以等量的蒸餾水灌胃。灌胃期間,每周稱量1次體質量,按照體質量調整給藥劑量,1次/d,連續(xù)6 w持續(xù)給藥。

1.6骨折愈合情況及骨痂BMD分析 各組大鼠連續(xù)治療后,采用X線側位片對右側股骨骨折愈合情況進行分析,骨折愈合情況根據X線片評分進行比較:骨折線清晰,沒有明顯骨膜反應為0分;骨折線趨于模糊,有輕微骨膜反應為1分;骨折處邊緣較模糊,有少量骨痂形成,骨膜反應較淺為2分;骨折處邊緣接近消失,有較深的骨膜反應,骨痂明顯增多為3分;骨折裂痕完全消失,骨膜反應密度接近骨影,骨痂BMD接近骨皮質密度為4分〔10〕。各組評分取平均值,評分越高,預示骨折愈合情況越好。

1.7骨痂體積測量 各組做完X射線檢測后,處死,收集大鼠血清(n=10),-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取右側股?剔除周圍肌肉組織,用游標卡尺測量骨痂最大半徑(R1)、長度L及股骨干半徑(R2),計算骨痂體積,體積(V)=2πR2(R1-R2)L。

1.8血清堿性磷酸酶 (ALP)、骨鈣素、鈣和磷水平檢測 使用自動生化分析儀測定血清ALP、骨鈣素、鈣和磷水平。

1.9酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測 使用ELISA試劑盒對股骨組織中的MDA、SOD和GSH-Px水平進行檢測,具體操作根據說明書進行。

1.10組織形態(tài)學觀察 將各組大鼠股骨中段骨折處骨痂組織剝離,進行常規(guī)石蠟切片的制備,并進行蘇木素-伊紅(HE)染色,于光學顯微鏡下觀察各組大鼠股骨骨痂組織病理形態(tài)。其余股骨組織置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11Western印跡檢測股骨組織中AMPK/sirt1/RANKL/OPG信號通路有關蛋白表達。將冰冷裂解緩沖液添加到股骨組織碎塊中。將樣品研磨勻漿,4 ℃,12 000 r/min離心2 min,分離上清液進行進一步分析。蛋白樣品經12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中進行蛋白質分離。將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,在5%脫脂牛奶中封閉過夜,并用吐溫20 Tris緩沖鹽溶液(TBS)洗滌3次。加入AMPK、sirt1、OPG、RANKL和β-actin一抗(稀釋倍數1:1 000),4 ℃孵育過夜,用TBS洗滌3次。加入二抗辣根過氧化物酶(HRP)耦聯的山羊抗兔抗體,并在室溫下培養(yǎng)2 h。使用電化學發(fā)光(ECL)試劑進行顯色,Odyssey成像系統(tǒng)和分析軟件進行半定量分析。

1.12統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1骨折愈合情況及BMD測定結果 骨質疏松造模術后6 w,模型組和藥物處理各組股骨組織BMD值顯著低于假手術組(P<0.05),提示造模成功。藥物灌胃6 w后,與模型組相比,藥物處理各組BMD值和骨折愈合的X線評分明顯升高(P<0.05)。且補陽還五湯低、中、高劑量組BMD值和骨折愈合的X線評分依次升高,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2補陽還五湯對大鼠股骨組織中MDA、SOD和GSH-Px水平的影響 與假手術組相比,模型組股骨組織中MDA水平顯著升高(P<0.05),SOD和GSH-Px水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,補陽還五湯各劑量組股骨組織中MDA水平顯著降低(P<0.05),SOD和GSH-Px水平顯著升高(P<0.05),且呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.3骨痂體積測量結果 與假手術組相比,模型組和藥物處理各組骨痂體積顯著增加(P<0.05);與模型組相比,補陽還五湯各劑量組骨痂體積隨著藥物劑量增加逐漸增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4補陽還五湯對ALP、骨鈣素、鈣和磷水平的影響 與假手術組相比,模型組血清ALP、骨鈣素、鈣和磷水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,補陽還五湯各劑量組血清ALP、骨鈣素、鈣和磷水平顯著降低,且呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

2.5大鼠股骨組織病理形態(tài) 光學顯微鏡下觀察可見(圖1),假手術組骨痂骨小梁最為完整且分布均勻,成骨數量較多;模型組骨痂骨小梁數量較少且分布紊亂,其中有大量纖維組織,成骨細胞數量減少;補陽還五湯各劑量組骨痂骨小梁數量介于對照組與假手術組之間,分布較模型組密集,成骨細胞數量也有所增加,其中補陽還五湯高劑量組骨折愈合更為明顯。

2.6補陽還五湯對骨組織中AMPK/sirt1/RANKL/OPG通路有關蛋白表達的影響 與假手術組相比,模型組骨組織AMPK、sirt1、OPG蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),RANKL蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,補陽還五湯各劑量組的AMPK、sirt1、OPG蛋白表達水平明顯升高(P<0.05),RANKL蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)且呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表3、圖2。

表1 各組BMD值和X線評分及股骨組織中MDA、SOD和GSH-Px水平

表2 各組骨痂體積、血清ALP、骨鈣素、鈣和磷水平比較

圖1 各組骨痂組織(HE染色,×200)

表3 各組骨組織中AMPK/sirt1/RANKL/OPG通路蛋白相對表達水平

1～5:假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組圖2 各組骨組織AMPK/sirt1/RANKL/OPG 通路蛋白表達

3 討 論

骨質疏松是骨骼的原發(fā)疾病,是骨折的最常見原因。由于人口老齡化,骨質疏松和低骨量的患病率預計會逐年增加〔11〕。骨質疏松的發(fā)病與多種因素有關,其中絕經后骨質疏松是由女性絕經引起的,占原發(fā)性骨質疏松的80%。經典的骨質疏松模型制備方法即為摘除雌鼠卵巢,快速降低雌激素含量。本研究采用此種方法構建骨質疏松模型,并經手術后,制備骨質疏松骨折大鼠模型。BMD在臨床中用作骨質疏松和骨折風險的間接指標〔12〕。

本研究結果表明,補陽還五湯對骨質疏松性骨折具有明顯的改善作用。血清ALP、鈣和磷是經典的骨轉換標志物。本研究結果表明,補陽還五湯可具有抑制破骨細胞分化的能力;骨質疏松骨折大鼠的氧化過程和抗氧化防御機制不平衡,即氧化應激反應增加,抗氧化系統(tǒng)受損;補陽還五湯可通過減少氧化應激,從而防止或減少骨質流失。

在正常生理情況下,活性氧(ROS)的產生與抗氧化防御系統(tǒng)處于平衡狀態(tài),一旦由于衰老、雌激素缺乏或其他因素導致平衡受損,則會發(fā)生氧化應激,從而導致廣泛的氧化損傷,對細胞生長、分化和增殖產生負面影響。若不受控制,破骨細胞產生的自由基會加速鈣化組織的損傷,阻礙骨骼重建,進一步損害骨骼的愈合和發(fā)育過程〔13〕。ROS誘導成骨細胞和骨細胞的凋亡,從而有利于破骨細胞生成。骨細胞過度凋亡與氧化狀態(tài)增加相關,導致有利于破骨細胞生成的失衡〔14〕。由成骨細胞和骨細胞產生的幾種因子,最重要的是RANKL和OPG,調節(jié)破骨細胞和成骨細胞的活性。NF-κB 受體激活劑(RANK)是破骨細胞表達的腫瘤壞死因子家族的成員。調節(jié)骨吸收的最后一個共同途徑涉及RANK與RANKL的相互作用〔15〕。抑制RANKL顯著影響骨代謝,因此是治療骨質疏松和其他以骨轉換增加為特征的骨病的合理治療策略。OPG是RANKL的天然抑制劑,OPG缺乏小鼠出現骨質疏松,而小鼠中OPG的過度表達抑制破骨細胞生成并改善骨量〔12〕。本研究表明,補陽還五湯可調節(jié)骨代謝過程,改善骨質疏松骨折癥狀。

sirt1是第一個被發(fā)現的Sirtuin蛋白家族成員,可調節(jié)包括NF-κB在內的分子,使sirt1能夠調節(jié)炎癥〔16〕。在氧化應激過程中,AMPK可增加sirt1的活性,從而促進NF-κB的表達。本研究結果表明補陽還五湯可通過調節(jié)骨質疏松骨折大鼠體內的氧化應激反應,從而影響RANKL/RANK/OPG系統(tǒng),參與骨重建,促進骨愈合。

綜上,補陽還五湯可能通過調節(jié)AMPK/sirt1/RANKL/OPG通路,抑制破骨細胞分化,改善氧化應激,促進骨質疏松骨折的骨愈合,從而起到臨床治療的作用。然而,補陽還五湯的臨床應用是否涉及其他作用機制,仍需進一步研究。