PAX1檢測在子宮頸癌篩查及預后判定中的臨床價值及相關分子機制

劉頁玲 王凌云 賴海麗 陳精銳 周潔 尹春華

(1江西衛生職業學院,江西 南昌 330052;2贛州市婦幼保健院婦產科;3南昌大學第一附屬醫院婦產科)

子宮頸癌(CC)是女性常見惡性腫瘤,其患病率及死亡率均處于較高水平〔1〕。我國作為CC高發地區,每年約有13萬人群發病,給女性身心健康帶來嚴重威脅〔2〕。CC發生及進展比較緩慢,通常需要持續10～30年,故經積極有效的干預后,早期CC患者治愈率高達100%〔3〕。人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染是引發CC的關鍵原因,HPV-DNA檢測應用于CC篩查敏感性較高,然而其特異性較低〔4〕。有研究證實,僅不到1%的HPV感染人群可進展為CC〔5〕。HPV-DNA檢測方式的不足引發的漏診及過診對臨床造成極大困擾,故探究新型檢測方式以辨別高級病變隨CC早期篩查尤為重要。DNA甲基化是DNA的一種表觀遺傳修飾,其可導致抑癌基因轉錄失活,進而引發腫瘤〔6〕。研究證實,多個基因異常甲基化與CC發展直接相關。配對盒家族基因(PAX)1可通過調節細胞內信號轉導進而阻斷基因轉錄進程〔7〕,已有研究證實,PAX1在CC標本中發生異常甲基化,說明該基因在CC早期發現中意義重大〔8,9〕。然而目前針對PAX1與CC研究報道較少,本研究探討PAX1甲基化在子宮頸癌篩查及預后判定中的臨床價值及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1組織標本 選擇2018年12月至2021年6月在贛州市婦幼保健院就診的CC患者90例,取其腫瘤組織,平均年齡(51.13±9.51)歲。納入標準:(1)經病理學檢查明確診斷為CC;(2)年齡>20歲;(3)臨床病理資料完整;(4)術前未進行任何治療;(5)患者或家屬均知曉本研究并簽署知情同意書;(6)經醫院倫理委員會審批通過。排除標準:(1)合并惡性腫瘤者;(2)代謝異常者;(3)中途退出研究者;(4)合并精神障礙、依從性差者。納入同期于醫院進行治療的宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)患者74例,并取其CIN組織,CIN Ⅰ 19例,CIN Ⅱ 25例,CIN Ⅲ 30例,平均年齡(51.13±6.12)歲。納入同期于醫院實施子宮全切除術的患者45例,取其正常宮頸組織,平均年齡(48.75±7.89)歲。3組年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2細胞 正常宮頸細胞系ECT1/E6 E7購于上海冠導生物細胞庫;宮頸癌細胞系Hela購于無錫欣潤生物細胞庫。

1.3QMSP定量檢測PAX1甲基化 提取組織標本DNA并采用亞硫酸氫鹽處理,然后將處理后的DNA作為模板。聚合酶鏈反應(PCR)條件:95 ℃預變性10 min,94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共50個循環。甲基化率采用甲基化指數(PMR)量化。

1.4免疫組化法檢測PAX1表達 取石蠟標本進行切片并通過免疫組化法檢測其中PAX1表達情況。將切片分別置于二甲苯及梯度酒精中浸泡,經PBS液沖洗后置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中行抗原修復,采用血清封閉,PAX1 1∶100稀釋,滴加一抗并于4 ℃環境下孵育過夜,滴加二抗于37 ℃環境下孵育,經二氨基聯苯胺(DAB)試劑顯色后終止反應,經蘇木素復染、脫水透明后自然風干,然后封片。

1.5細胞轉染及分組 將所需細胞常規培養24 h,然后以1 500 r/min的速度離心10 min,將沉淀取出并采用DMEM重懸,孵育24 h并傳代,取第3代細胞以4×106/孔的密度植于培養基,代細胞融合度達80%時更換培養基(無胎牛血清)。

將Hela細胞分為空白對照組(不進行處理常規培養)、PAX1 mimics NC組(轉染PAX1 mimics NC)、PAX1 mimics組(轉染PAX1 mimics)、PAX1 inhibition NC組(轉染PAX1 inhibition NC)、PAX1 inhibition 組(轉染PAX1 inhibition )。每組均設置3個重復,48 h采集細胞以待檢測。

1.6細胞增殖能力檢測 噻唑藍(MTT)法:取對數生長期細胞消化后制備細胞懸液并計數,放入培養箱中孵育,分別于24、48、72 h時在每孔中添加10 ml 5 g/L MTT溶液,加二甲基亞砜后于550 nm處檢查各孔吸光度(OD)值。

1.7細胞遷移能力檢測 劃痕實驗檢測細胞遷移能力。取處于對數生長期的細胞,采用絲裂霉素C處理,1 h后取200 μl移液槍頭進行劃痕處理,清洗細胞表面后鏡檢標記細胞原始位置,孵育24 h后拍照并計算遷移細胞數。

1.8Transwell法檢測細胞侵襲能力 采用RPMI1640培養基稀釋基質膠,將稀釋后的基質膠涂于上層小室,在37 ℃環境下培養4 h,然后放入不含血清的DMEM溶液中重懸。上層小室每孔中均加入100 μl細胞懸液,下層小室加含胎牛血清的培養基,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養,24 h后取出小室,經磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后擦拭膜上基質膠和未穿過的細胞,采用吉姆薩(Giemsa)染色后置于倒置顯微鏡下觀察。

1.9細胞相關基因蛋白表達檢測 實時熒光定量(RT-q)PCR、Western印跡檢測細胞PAX1及Wnt/β-catenin 信號通路相關分子〔上皮鈣依賴黏附蛋白(E-cadherin)、β-catenin〕mRNA及蛋白表達水平。RT-qPCR法:提取細胞總RNA,然后經反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA后實施PCR擴增,同時測定條帶亮度,PAX1、E-cadherin、β-catenin基因mRNA表達量為目的基因參與內參β-actin條帶亮度比值。Western印跡:提取細胞總蛋白并進行濃度測定,按照蛋白Marker確定時間實施電泳,轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,置于5%脫脂牛奶行封閉處理,加一抗、二抗后洗膜,加電化學發光(ECL)進行膠片曝光、顯影、定影后分析目標蛋白PAX1、E-cadherin、β-catenin表達量。

1.10統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗;采用受試者工作特征(ROC)曲線分析PAX1檢測在子宮頸癌篩查及預后判定中的價值。

2 結 果

2.1PAX1在不同宮頸組織中的甲基化水平比較 正常宮頸(3.17±2.85)、CIN Ⅰ(5.09±4.16)、CIN Ⅱ(7.49±4.72)、CIN Ⅲ組織中PAX1 PMR值(13.10±10.91)均較CC組織(76.38±31.72)顯著降低(P<0.05);CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ組織中PAX1 PMR值均較正常宮頸組織顯著升高,且隨CIN分級增加而明顯升高(P<0.05)。

2.2PAX1基因甲基化診斷CC的價值 PAX1甲基化診斷CC的曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度分別為0.97、93.20%、62.25%。見圖1。

圖1 ROC曲線分析PAX1診斷CC的效能

2.3PAX1在不同宮頸組織中的表達 正常宮頸〔41例(9.11%)〕、不同CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組織PAX1陽性表達率〔17例(89.47%)、18例(72.00%)、19例(63.33%)〕均較CC組織〔35例(38.89%)〕顯著升高(P<0.05);CIN Ⅱ、CIN Ⅲ組織PAX1陽性表達率均較正常宮頸組織顯著升高(P<0.05)。見圖2。

2.4PAX1蛋白對CC患者預后的價值 PAX1蛋白對CC患者預后的AUC、靈敏度、特異度分別為0.829、90.00%、62.40%。見圖3。

2.5PAX1在正常宮頸細胞及宮頸癌細胞中的表達 Hela細胞系PAX1 mRNA(0.11±0.02)及蛋白表達水平(0.09±0.01)較ECT1/E6 E7細胞系mRNA及蛋白表達(0.38±0.01、0.36±0.02)顯著降低(t=46.765、46.765,均P<0.001)。見圖4。

圖2 PAX1在不同宮頸組織中的表達(免疫組化,×400)

2.6各組細胞增殖能力比較 在24、48、72 h時,PAX1 mimics組細胞增殖能力較空白對照組顯著降低(P<0.05);PAX1 inhibition 組細胞增殖能力較空白對照組顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖能力(OD值)比較

2.7各組細胞遷移及侵襲能力比較 PAX1 mimics組細胞遷移及穿膜數均較空白對照組顯著降低(P<0.05);PAX1 inhibition組細胞遷移及穿膜數均較空白對照組顯著升高(P<0.05)。見表2、圖5。

2.8各組Wnt/β-catenin 信號通路相關因子mRNA及蛋白表達比較 PAX1 mimics組β-catenin mRNA及蛋白表達水平均較空白對照組顯著降低,E-cadherin mRNA及蛋白表達水平均較空白對照組顯著升高(P<0.05);PAX1 inhibition組β-catenin mRNA及蛋白表達水平均較空白對照組顯著升高,E-cadherin mRNA及蛋白表達水平均較空白對照組顯著降低(P<0.05)。見表2、圖6。

表2 各組細胞遷移、侵襲能力和β-catenin、E-cadherin mRNA及蛋白表達比較

圖5 各組細胞遷移、侵襲能力

1～5:空白對照組、PAX1 mimics NC組、PAX1 mimics組、PAX1 inhibition NC組、PAX1 inhibition組圖6 各組細胞β-catenin、E-cadherin蛋白表達比較

3 討 論

DNA甲基化在腫瘤發生過程中發揮關鍵作用,有報道證實,基因組DNA基因異常甲基化可參與腫瘤起病及演變過程,且與患者臨床預后相關〔10〕。采用CC特定DNA高度甲基化測定結果可判斷CC發生風險,在CC患者篩查、分流和隨訪測定過程中具有重要作用。

多項研究顯示,PAX1甲基化與CC發展密不可分,有研究顯示,PAX1基因在CC組織中發生異常甲基化,且甲基化異常頻率為94.5%,說明該基因在CC早期診斷中意義重大〔11〕。Xu等〔12〕通過研究PAX1在CC組織中的甲基化情況發現,PAX1甲基化陽性率高達87.50%,且其陽性率隨疾病進展呈顯著增加趨勢。PAX1在宮頸病變組織中甲基化程度較正常宮頸組織存在明顯區別,故PAX1甲基化檢測有望成為CC臨床評估中極為重要指標。

有學者通過對比PAX1甲基化與HPV在高度鱗狀上皮內病變及鱗狀細胞癌中的檢測效率發現,PAX1甲基化檢測具有較高的靈敏度,且進一步探究發現,PAX1甲基化可明顯增加CC檢測靈敏度,提示該基因甲基化可參與CC發生發展過程〔13〕。本研究結果說明,在CC起病過程中PAX1可能是作為腫瘤抑制基因發揮作用,PAX1甲基化在CC早期診斷中價值較高。本研究結果顯示,PAX1在子宮頸病變發展過程中,PAX1表達陽性率逐漸減少,且CC組織最低,這可能是由于PAX1甲基化可導致啟動子沉默進而阻斷基因轉錄進程,與此同時,其自身蛋白PAX1表達亦被阻斷,而PAX1表達下調在CC發生發展過程中發揮促進作用。

PAX1可參與胚胎發育環節并調節細胞分化、凋亡等生物學行為,可作為細胞系特定調節因子之一〔14〕。近年來針對PAX1的研究顯著增多,其已被證實在腫瘤生長環節中扮演重要角色〔15,16〕。臨床研究顯示,PAX1在口腔鱗癌細胞HN4中的表達量顯著減少,且下調細胞內PAX1表達后,HN4細胞增殖率、穿膜細胞數及遷移細胞數顯著增加,說明下調PAX1表達可促進HN4增殖、侵襲及遷移〔17〕。本研究結果說明,低表達PAX1對Hela細胞增殖、侵襲及遷移發揮一定正向調控作用。Wnt/β-catenin通路可促進細胞上皮間質化,有報道顯示,β-catenin及E-cadherin在該通路中發揮關鍵作用,可與相關蛋白于膜上產生復合物,若前者胞外區域發生水解,后者即被分泌,進而阻斷 E-cadherin轉錄而產生上皮細胞間質化〔18,19〕。有研究敲低魚類PAX1表達后發現,Wnt通路被激活,但上調PAX1表達后Wnt通路被抑制〔20〕。本研究結果提示,PAX1對宮頸癌發生、進展的調節可能與Wnt/β-catenin通路密不可分。

綜上,PAX1檢測在CC臨床篩查及早期病情評估方面具有較高價值,且上調PAX1表達可阻斷CC細胞增殖、侵襲及遷移,其作用機制可能是通過調控Wnt/β-catenin通路實現的,可為PAX1在CC靶向治療提供理論依據。然而本次研究只是針對Wnt/β-catenin這一具有代表性的通路對CC起病及進展機制進行分析,在以后的研究中將針對更多與CC有關的信號通路及基因進行探究。