電針對(duì)老年大鼠激素性股骨頭壞死骨細(xì)胞凋亡的影響

金紅光 石樁 王新華 尼瑪 付勇

(1江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科,江西 南昌 330006;2內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科)

類固醇是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要誘發(fā)因素。隨著糖皮質(zhì)激素在治療風(fēng)濕性免疫性疾病中的廣泛應(yīng)用,且我國(guó)老齡化人口增多,激素性股骨頭壞死(SANFH)患病率逐年增加,如不及時(shí)治療,最終可導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)的塌陷。當(dāng)前,SANFH 的發(fā)病機(jī)制并不明確,有研究表明激素導(dǎo)致的骨細(xì)胞凋亡與股骨頭壞死關(guān)系密切〔1〕。針灸在治療骨科疾病方面具有顯著作用〔2〕。電針屬于針灸的一種,也是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)針刺麻醉或針刺鎮(zhèn)痛的獨(dú)特治療方式,具有客觀、定量地設(shè)定刺激頻率和強(qiáng)度的優(yōu)點(diǎn)。電針可影響細(xì)胞凋亡改善疾病狀態(tài)。電針調(diào)節(jié)大鼠肉瘤蛋白-原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶-分裂原活化抑制劑(Ras-RaF-MEK)1/2-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞凋亡〔3〕。電針足三里(ST36)和懸鐘(GB39)穴位可通過(guò)調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,顯著改善大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎損傷〔4〕。電針可抑制脊髓損傷后細(xì)胞凋亡,減輕脊髓繼發(fā)性損傷,有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)〔5〕。然而,電針療法是否具有防治激素性股骨頭壞死作用尚不清楚。故本文擬采用脂多糖(LPS)聯(lián)合激素處理構(gòu)建大鼠股骨頭壞死模型,并從細(xì)胞凋亡方面考察電針緩解SANFH的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取健康雄性SD大鼠30只(6～8周齡、體質(zhì)量200～220 g)。大鼠置于環(huán)境溫度為(25±2)℃、相對(duì)濕度為50%±10%、通風(fēng)良好且晝夜交替12 h的屏障環(huán)境中適應(yīng)1 w,將其飼養(yǎng)到80周齡。

1.2動(dòng)物分組、模型構(gòu)建 將大鼠隨機(jī)分成3組,每組10只,分別為:正常組、模型組和模型+電針組。采用LPS(Solarbio公司,L8880)聯(lián)合甲潑尼松龍(MPS,比利時(shí)輝瑞,AP5394)構(gòu)建大鼠SANFH 模型〔6〕,具體方法:給大鼠臀肌注射慶大霉素16×104U/次,連續(xù)3次,每次間隔24 h;于第4、5天腹腔分別注射LPS(20 μg/kg),并在第5～7天臀肌注射劑量為40 mg/kg的 MPS,注射時(shí)間間隔24 h。第8天開(kāi)始連續(xù)7 d臀肌注射慶大霉素16×104U/次。

1.3電針干預(yù) 模型構(gòu)建成功后,模型+電針組每天用電針治療儀(蘇州醫(yī)療,SDZ-Ⅱ)依次電針環(huán)跳、居髎、陽(yáng)陵泉(雙側(cè)穴位)穴位,強(qiáng)度0.5 mA,頻率2 Hz/15 Hz,每次30 min,總共電針25 d。然后處死大鼠,收集血液和股骨頭,將股骨頭分別保存于固定液和液氮中。

1.4組織病理學(xué)觀察 將股骨頭先用10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣,接著浸入蒸餾水中清洗,最后以流水沖洗后采用蘇木素-伊紅(HE)染色〔8〕,光鏡下拍照觀察股骨頭組織病理學(xué)變化。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因 取大鼠兩側(cè)股骨頭0.1 g,放入已裝有1 ml Trizol的離心管內(nèi),參照TRIzol試劑說(shuō)明書提取股骨頭組織中總的RNA,再按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)和熒光定量試劑盒(RR820A)對(duì)各組組織中B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)mRNA表達(dá)情況進(jìn)行定量,以2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量,引物序列見(jiàn)文獻(xiàn)〔7〕。

1.6TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡數(shù) 參照文獻(xiàn)〔7,9〕所述方法,將股骨頭從固定液中取出,自來(lái)水沖洗,分別以不同濃度乙醇、二甲苯和石蠟脫水,再行石蠟包埋,切片機(jī)切厚度為5 μm切片;依次進(jìn)行烤片(65 ℃ 2 h),二甲苯(10 min ×2次),不同濃度乙醇洗(100%、95%、80%,各5 min);37 ℃條件下以50 μg/ml蛋白酶 K孵育切片30 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次5 min;根據(jù)TUNEL試劑盒操作說(shuō)明書(碧云天生物,C1088),于熒光顯微鏡下觀察綠色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7免疫組化法觀察細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 參照金紅光等〔7〕所述方法獲得脫水的大鼠股骨頭切片后,水洗,高壓抗原修復(fù)(3 min),滴加3% H2O2除過(guò)氧化物酶活性,PBS洗3次,每次5 min,室溫孵育盒內(nèi)封閉2 h,分別加Bax(Abcam公司,ab32503)和Bcl-2(Abcam公司,ab196495)一抗工作液,稀釋比例均為1∶1 000,過(guò)夜孵育;PBS洗3次,每次5 min;室溫孵育二抗2 h;PBS洗3次,每次5 min;加辣根過(guò)氧化物酶,孵育15 min;再以含吐溫20的PBS(PBST)洗3次,每次5 min;最后加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液,孵育100 s,于顯微鏡下觀察切片上的顏色變化;一旦出現(xiàn)棕色,以自來(lái)水沖洗切片;再依次進(jìn)行蘇木素染色、分化、脫水和封片。顯微鏡下從每張切片中隨機(jī)選擇5個(gè)陽(yáng)性視野,按如下公式計(jì)算陽(yáng)性染色區(qū)的光密度值:陽(yáng)性區(qū)平均光密度度值/陽(yáng)性區(qū)面積=凋亡蛋白表達(dá)水平。

1.8Western印跡檢測(cè) 以液氮研磨股骨頭成粉末狀,以每0.1 g粉末加入1 ml放射免疫沉淀法裂解緩沖液(RIPA)裂解液置于離心管中,充分混合后于冰上孵育30 min;低溫高速離心10 min,收集上清并檢測(cè)蛋白濃度。取40 μg總蛋白依次進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、濕法轉(zhuǎn)膜、一抗溶液過(guò)夜孵育〔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)濃度1∶2 000,Caspase-3濃度1∶1 000(Abcam公司,ab184787),Bcl-2濃度1∶1 000〕、漂洗、二抗溶液孵育2 h和成像系統(tǒng)內(nèi)曝光拍攝;檢測(cè)蛋白條帶灰度值,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式如下:目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad prism8.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1電針對(duì)大鼠激素性股骨頭壞死的影響 正常組股骨頭軟骨細(xì)胞排列規(guī)則整齊,周圍可見(jiàn)成骨細(xì)胞和少量破骨細(xì)胞,骨細(xì)胞內(nèi)空骨陷窩和核固縮較少,未見(jiàn)壞死區(qū)。模型組股骨頭空骨陷窩增加,部分軟骨細(xì)胞呈簇狀肥大,排列不整齊,骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量核固縮和壞死區(qū)。電針組股骨頭有少量空骨陷窩,軟骨細(xì)胞規(guī)則尚整齊。見(jiàn)圖1。

2.2電針對(duì)骨細(xì)胞凋亡的影響 與正常組骨細(xì)胞凋亡數(shù)〔(76.7±16.8)個(gè)〕比較,模型組骨細(xì)胞凋亡數(shù)〔(385.00±27.39)個(gè)〕顯著增加(t=16.640,P<0.000 1);與模型組比較,模型+電針組骨細(xì)胞凋亡數(shù)〔(217.7±33.6)個(gè)〕顯著減少(t=21.900,P=0.000 5)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組股骨頭形態(tài)(HE染色,×100)

圖2 各組骨細(xì)胞凋亡(×100)

2.3電針對(duì)股骨頭組織中Bax和 Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較,模型組Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,模型+電針組Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。而Bcl-2蛋白在模型組股骨頭組織中表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05);與模型組相比,模型+電針組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

2.4電針對(duì)骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 與正常組相比,模型組Bax mRNA表達(dá)水平顯著增加,Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05);與模型組相比,模型+電針組Bax mRNA表達(dá)顯著降低,抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.5電針對(duì)骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 與正常組比較,模型組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01),Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加 (P<0.01);與模型組相比,模型+電針組Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),Bcl-2表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖4。

表1 各組股骨頭Bax、Bcl-2基因及Caspase-3表達(dá)比較

圖4 Western印跡檢測(cè)3組骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

3 討 論

SANFH患者多為中老年人,其數(shù)量居非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者的首位,在臨床上常見(jiàn),發(fā)病率高達(dá)40%〔10〕。SANFH是雙側(cè)對(duì)稱的,壞死范圍廣,致殘率高,給患者及其家人帶來(lái)了災(zāi)難性的負(fù)擔(dān)。目前SANFH臨床尚缺乏切實(shí)有效的治療方法,疾病預(yù)后較差。本文結(jié)果表明,電針可通過(guò)抑制骨細(xì)胞凋亡,抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)、促進(jìn)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著緩解老年大鼠SANFH。

電針作用于穴位,持續(xù)刺激穴位,促進(jìn)體內(nèi)內(nèi)源性阿片肽的釋放〔11〕。內(nèi)源性阿片肽可與阿片肽受體結(jié)合,產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用〔12〕。調(diào)整穴位的電流強(qiáng)度、頻率和作用時(shí)間可以增強(qiáng)針刺誘導(dǎo),改善局部微循環(huán),疏通局部經(jīng)絡(luò),并達(dá)到抑制壞死的效果。電針可抑制皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的變性和壞死,改善線粒體損傷〔13〕,還能促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)〔14〕。

凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡過(guò)程,可由促凋亡和抗凋亡蛋白如Caspase家族和Bcl-2家族調(diào)節(jié)〔15〕。骨細(xì)胞凋亡是激素性股骨頭缺血性壞死的主要表現(xiàn)〔16〕。研究表明,電針通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路促進(jìn)脊髓損傷大鼠的恢復(fù),促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化〔17〕。電針通過(guò)降低神經(jīng)元凋亡與氧化應(yīng)激減輕慢性腦灌注不足導(dǎo)致的大鼠認(rèn)知損害〔18〕。電針大椎(GV14)和命門(GV4)后,通過(guò)磷脂酰激酶-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路影響細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和自噬改善大鼠脊髓損傷〔19〕。電針通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α/NF-κB信號(hào)通路抑制創(chuàng)傷大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡〔20〕。本研究表明,電針可下調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達(dá),上調(diào)抑凋亡Bcl-2表達(dá),抑制骨細(xì)胞的凋亡。至于電針通過(guò)何種機(jī)制影響促凋亡和抗凋亡蛋白的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。