TGFA通過PI3K/AKT信號通路對骨關節炎小鼠軟骨細胞增殖和凋亡的影響

崔國峰 劉丹 武軍龍 魏戎 劉瑞宇 王坤正

(1西安交通大學附屬第二醫院骨與關節外科,陜西 西安 710004;2鄭州大學附屬洛陽中心醫院骨科;3西安醫學院第一附屬醫院風濕免疫科)

骨關節炎(OA)是一種慢性關節退行性疾病,以膝OA(KOA)最為常見,主要發生在中老年人群體,以關節軟骨退變為主要病理特征〔1～3〕。關節軟骨退變過程涉及軟骨細胞的性狀改變、數量減少及骨基質退行性病變〔4〕。研究表明,正常的軟骨細胞是確保細胞外基質狀態穩定的必要條件,而軟骨細胞增殖、凋亡行為的失衡是軟骨退行性病變引起OA發生的關鍵〔5〕。目前尚無能有效治愈OA的方法,OA的臨床治療主要在于延緩病情進展〔6,7〕。從軟骨細胞增殖、凋亡方面著手或可為尋找新的OA治療藥物指明方向。轉化生長因子α(TGFA)是表皮生長因子(EGF)家族成員,可結合EGF受體引發各種信號轉導級聯反應,在細胞行為調控方面發揮重要作用〔8〕。既往研究顯示,TGFA能增強上皮細胞增殖和運動〔9〕。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)是機體中的基礎信號通路之一,參與絕大多數生命活動,如其激活后可促進癌細胞增殖、侵襲〔10〕。有研究發現,PI3K/AKT通路與OA發病關系密切,其激活后可抑制軟骨細胞凋亡〔11,12〕。本研究將探討TGFA通過PI3K/AKT信號通路對OA小鼠軟骨細胞增殖和凋亡的影響,以期為延緩OA病情提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠,體質量20～30 g,8周齡,購自杭州科玲生物科技有限公司,許可證號:SCXK(浙)2020-0007。小鼠購進后適應性喂養1 w,12 h/12 h明暗光照,溫度19～23 ℃,相對濕度40%～60%,自由攝食飲水。

1.2主要試劑與儀器 小鼠Ki67、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3免疫組化試劑盒(IHC0117710、IHC0118094)及噻唑藍(MTT)溶液(YS290LG)、膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒(G003)購自雅吉生物;DMEM培養基(iCell0001)購自上海iCell;白細胞介素(IL)-1β(GFM68-2)、TGFA(GFH209-10)購自英國CellGS;LY294002(HY-10108)購自美國MedChemExpress;兔抗p-PI3K(KF275)、兔抗PI3K(KF650)、兔抗p-AKT(KF044)、兔抗AKT(KF359)、兔抗GAPDH抗體(KF703)、羊抗兔IgG(KS002)購自南京建成生物工程研究所;兔抗Ki67(db901)、兔抗Caspase-3(db9853)購自戴格生物;BX53顯微鏡購自日本OLYMPUS;51119000全自動酶標儀購自美國賽默飛;AMG0002051流式細胞購自美國BD;ChemiDocTMXRS+凝膠成像儀購自美國Bio-Rad。

1.3OA小鼠模型制備及實驗分組 OA小鼠模型復制〔13〕:小鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,固定,雙側后肢消毒、備皮,在膝關節處切開皮膚(3 mm),鈍性分離肌肉,暴露關節腔和內側半月板脛骨韌帶,將內側半月板韌帶劃斷,止血,生理鹽水沖洗傷口,縫合關節腔軟組織及皮膚,給予青霉素肌注3 d防感染。取8只OA小鼠為模型組,另取同期未劃斷內側半月板韌帶的8只小鼠為假手術組,正常飲水進食,自行活動4 w。

1.4免疫組化法檢測軟骨組織細胞增殖、凋亡情況 將小鼠斷頭處死,分離左后肢膝關節軟骨組織用于Western印跡檢測,分離右后肢膝關節軟骨組織用4%多聚甲醛固定,放乙二胺四乙酸(EDTA)中脫鈣,經脫水、包埋后切片(5 μm)。將切片脫蠟、水化、漂洗,加檸檬酸鈉緩沖液用微波爐加熱修復抗原10 min,冷卻后用3%H2O2浸泡10 min,沖洗,分別滴加兔抗Ki67、兔抗Caspase-3,4 ℃孵育8 h,沖洗,滴加羊抗兔IgG二抗,孵育15 min,沖洗,用二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色、蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、梯度乙醇復水、二甲苯透明后中性樹膠封固,顯微鏡下觀察染色結果,陽性細胞的胞質表現為棕黃色顆粒,計算陽性細胞率(%)=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.5OA小鼠軟骨細胞的分離、培養 取1只OA小鼠,斷頭處死,分離雙后肢膝關節軟骨組織,沖洗后切成1 mm3小塊,胰酶消化30 min,Ⅱ型膠原蛋白酶消化3 h,過濾除去未消化組織,濾液經1 000 r/min離心5 min,棄上清獲得OA小鼠軟骨細胞,用含0.1 mg/ml青-鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM培養基培養,2～3 d換液1次。

1.6OA小鼠軟骨細胞分組及給藥 將OA小鼠軟骨細胞分為對照組、TGFA低濃度組、TGFA高濃度組及通路抑制組,均加10 ng/ml IL-1β模擬OA環境,TGFA低、高濃度組另分別加5、10 ng/ml TGFA〔14〕,通路抑制組加10 ng/ml TGFA及10 μmol/L LY294002〔14〕。

1.7MTT法檢測細胞增殖 各組OA小鼠軟骨細胞以5×104個/ml、100 μl/孔接種96孔板,培養24 h,加入50 μl/孔MTT溶液,繼續培養4 h,加入200 μl/孔DMSO,酶標儀(490 nm)測定每孔光密度(OD)值,以OD值表示細胞增殖能力。

1.8流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組OA小鼠軟骨細胞以5×104個/ml、100 μl/孔接種96孔板,培養24 h離心收集細胞,用結合緩沖液重懸為5×105個/ml,取500 μl細胞重懸液,依次加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC、5 μl PI輕輕混勻,避光放置10 min,流式細胞儀進行檢測,分析細胞凋亡率。

1.9Western印跡檢測軟骨組織、軟骨細胞中PI3K/AKT通路相關蛋白表達 小鼠左后肢膝關節軟骨組織及以5×104個/ml、1 ml/孔接種6孔板并培養24 h的各組OA小鼠軟骨細胞均用RIPA裂解液提取蛋白質,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質含量,取蛋白樣品以50 μg/孔點樣、電泳、轉膜、封閉,滴加p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、Ki67、Caspase-3、GAPDH抗體(1∶800),4 ℃孵育10 h,滴加羊抗兔IgG二抗(1∶1 200)孵育2 h,電化學發光(ECL)液染色,凝膠成像儀曝光、拍照,分析條帶灰度,以與GAPDH灰度值的比值為目的蛋白表達水平。

1.10統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1假手術組及模型組軟骨組織細胞增殖、凋亡情況 與假手術組相比,模型組軟骨組織Ki67陽性細胞率顯著降低,Caspase-3陽性細胞率顯著升高(P<0.05),見表1、圖1。

2.2假手術組及模型組軟骨組織中PI3K/AKT通路及增殖、凋亡相關蛋白表達情況 與假手術組相比,模型組軟骨組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見表1、圖2。

2.3各組軟骨細胞增殖情況 與對照組相比,TGFA低、高濃度組軟骨細胞OD值顯著升高(P<0.05);與TGFA低濃度組相比,TGFA高濃度組軟骨細胞OD值顯著升高(P<0.05);與TGFA高濃度組相比,通路抑制組軟骨細胞OD值顯著降低(P<0.05),見表2。

表1 兩組軟骨組織Ki67、Caspase-3陽性細胞率、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67、Caspase-3蛋白表達比較

圖1 兩組軟骨組織Ki67、Caspase-3 陽性細胞表達(免疫組化染色,×200)

2.4各組軟骨細胞中PI3K/AKT通路及增殖、凋亡相關蛋白表達情況 與對照組相比,TGFA低、高濃度組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67蛋白表達水平顯著升高,Caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與TGFA低濃度組相比,TGFA高濃度組軟骨細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67蛋白表達水平顯著升高,Caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與TGFA高濃度組相比,通路抑制組軟骨細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67蛋白表達水平顯著降低,Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見圖2、表2。

2.5各組軟骨細胞凋亡情況 與對照組相比,TGFA低、高濃度組軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與TGFA低濃度組相比,TGFA高濃度組軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與TGFA高濃度組相比,通路抑制組軟骨細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見表2、圖3。

1～6:假手術組、模型組、對照組、TGFA低濃度組、TGFA高濃度組、通路抑制組圖2 各組p-PI3K、PI3K、p-AKT、 AKT、Ki67、Caspase-3蛋白表達

表2 各組軟骨細胞OD值、凋亡率及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67、Caspase-3蛋白表達比較

圖3 各組軟骨細胞凋亡情況

3 討 論

軟骨細胞是軟骨組織唯一的細胞類型,也是軟骨進行代謝活動的主要成分,參與合成軟骨基質,其異常增殖及凋亡與OA的發生發展密切相關〔15〕。本研究采用劃斷后肢關節內側半月板韌帶的方式復制OA小鼠模型,驗證了OA發病中軟骨組織細胞增殖會異常降低,細胞凋亡異常升高。

TGF包括TGFA、TGF-β兩種多肽類生長因子,其中TGF-β是一種多功能蛋白質,參與關節炎發病的炎癥反應調節過程,而TGFA能誘導上皮進展,與EGF受體結合調控信號反應發揮作用〔16,17〕。研究發現,低氧誘導大鼠脂肪干細胞旁分泌因子〔包含TGFA、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)〕可以減輕子癇前期大鼠心肌組織細胞異常程度〔18〕。本研究結果表明,TGFA可減輕OA小鼠軟骨細胞損傷,抑制細胞凋亡并促進細胞增殖,但其機制還需進一步研究。AKT信號通路是調控細胞增殖、凋亡、蛋白質合成、糖代謝等各種生命活動的重要通路,可通過膜蛋白PI3K從EGF受體、酪氨酸激酶受體等多種受體處接收信號后磷酸化激活,目前已被認為是軟骨細胞凋亡的重要調控途徑〔19,20〕。田勝蘭等〔11〕研究發現,YKL-40可通過活化PI3K/AKT通路,抑制KOA兔軟骨細胞凋亡,修復軟骨損傷,延緩軟骨退行性改變。李坤等〔19〕研究表明,上調miR-543可拮抗IL-1β誘導的軟骨細胞損傷,促進軟骨細胞增殖,可能與上調AKT1等表達有關。呂欣榮等〔20〕研究亦發現,獨活寄生湯可治療IL-1β誘導的軟骨細胞損傷,其作用機制可能與上調PI3K、AKT表達有關。本研究結果表明,OA發生過程中PI3K/AKT通路受到抑制;TGFA可激活OA小鼠軟骨細胞中PI3K/AKT通路。Hou等〔14〕和Tao等〔21〕研究亦表明,TGFA可與EGF受體相互作用活化PI3K和AKT,參與癌細胞的增殖、遷移。本研究進一步發現,TGFA可能通過激活PI3K/AKT通路,促進OA小鼠軟骨細胞增殖并抑制細胞凋亡。

綜上所述,TGFA可促進OA小鼠軟骨細胞增殖并抑制細胞凋亡,其作用機制可能與激活PI3K/AKT通路有關。