基于SIRT1/NF-κB通路探究秦艽醇提物對脂多糖誘導大鼠背根神經節神經元炎性損傷的保護作用及機制

周松林 黃俊卿 李科 季鴻飛 都帥剛 楊彬

(河南省中醫院疼痛科,河南 鄭州 450002)

神經病理性疼痛是由中樞或周圍神經系統繼發性、原發性損害或功能障礙導致的慢性疼痛,作用機制為神經發生損傷后通過局部合成并釋放多種炎性疼痛相關因子,使脊髓痛覺傳遞神經元處于超敏化狀態,并增強傳入神經末梢的傷害性神經遞質的釋放,導致患者出現感覺異常、自發性疼痛及痛覺過敏等癥狀,給患者生活帶來沉重負擔〔1,2〕。背根神經節神經元(DRGn)來源于神經嵴脊神經節內神經母細胞的軸突部分,是軀體初級痛覺感受的重要神經元類型,常作為神經病理性疼痛模型細胞運用于研究中〔3,4〕。沉默信息調節因子(SIRT)1是一種核蛋白,可通過調節核因子(NF)-κB的去乙?；{控炎癥反應,在維持神經元功能、促進神經元軸突生長等方面發揮重要作用〔5,6〕。研究顯示,SIRT1/NF-κB通路在保護DRGn細胞免于炎癥損傷過程中發揮重要作用〔7〕。秦艽是龍膽科龍膽屬植物,主要分布在我國高海拔地區,其根和花可入藥,具有抗炎、解熱鎮痛、調節免疫等諸多作用〔8〕。目前研究顯示,秦艽醇提物能夠降低炎癥反應,緩解關節炎大鼠組織損傷〔9〕。本研究將使用脂多糖建立大鼠DRGn細胞炎性損傷模型,研究秦艽醇提物調控SIRT1/NF-κB通路對DRGn細胞炎性損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料與主要試劑 成年SD雌、雄性大鼠,體質量220～240 g,購于廣州賽業百沐生物科技有限公司,動物許可證號:SCXK(粵)2020-0055。適應性喂養1 w后,將雌、雄大鼠合籠過夜,次日清晨雌性大鼠經過陰道涂片確定妊娠成功后,單獨飼養,并記為妊娠第1天,至妊娠第15天時取材。DMEM培養基、淋巴細胞分離液、CCK-8試劑、膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒及白細胞介素(IL)-6、IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號:GOY-N0868、GOY-1205、GOY-9141、GOY-9887、GOY-E2864、GOY-E2868、GOY-E2853)購自上海谷研實業有限公司;秦艽(批號:20190517)購于張仲景大藥房,經院醫藥部鑒定為秦艽的干燥根,粉碎后用95%乙醇反復浸泡24 h,合并濾液并濃縮干燥得秦艽醇提物(有效提取率10%),冷藏備用;普瑞巴林(國藥準字H20203640)購自寧波美諾華天康藥業有限公司;Neurobasal培養基(貨號:21103049)購自美國Gibco;脂多糖(貨號:AL8880-10 mg)購自上海吉至生化科技有限公司;煙酰胺(貨號:YT337-PWY)購自北京百奧萊博科技有限公司;兔抗SIRT1、兔抗乙?；?Ac)-NF-κB p65、兔抗NF-κB p65、兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG(ab189494、ab19870、ab32536、ab181602、ab205718)購自美國Abcam公司;Multiskan MK3型酶標儀購自美國Thermo科技公司;Guauasoft 6L型流式細胞儀購自美國Millipor公司。

1.2大鼠制備模型、分組及給藥 成年SD雄性大鼠分為假手術組、模型組、陽性組和給藥組,每組6只。模型組、陽性組和給藥組建立脊髓損傷模型:大鼠用水合氯醛麻醉后固定在手術板上,背部皮膚備皮、切開暴露T11～S2節段椎板,摘除T12椎板,暴露硬脊膜包被的脊髓,用打擊器通過垂直下落的方式(5 g,10 cm)打擊脊髓,逐層縫合肌肉、皮膚,使用青霉素預防感染,而假手術組僅摘除T12椎板。造模結束14 d后,給藥組灌胃50 mg/kg秦艽醇提物,陽性組灌胃16 mg/kg普瑞巴林,假手術組和模型組灌胃等量生理鹽水,每日給藥1次,3 w結束。

1.3大鼠機械性觸痛閾值(PWPT)測定 各組大鼠建模前及給藥前后進行PWPT測定:大鼠置于行為實驗室適應30 min直至安靜,用機械測痛儀的VonFrey纖維絲(0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g)刺激大鼠后足掌心,以2.0 g為初始刺激強度,大鼠出現抬足、舔足、縮足樣行為等陽性反應時降低刺激強度,未出現陽性反應提高刺激強度,出現陽性反應的最低刺激強度記為PWMT,測試3次,取均值,每次測試至少間隔10 min,上一輪引起的陽性反應完全消失后進行下一輪測試。

1.4DRGn分離培養與純化 取妊娠15 d的SD雌性大鼠,腹腔注射麻醉,無菌操作取出胚胎,在體視顯微鏡下取出脊髓兩側的背根神經節(DRG),并剔除神經節被膜,裝入離心管中。將DRG用眼科剪剪碎,加入0.25%胰蛋白酶37 ℃水浴消化15 min,用DMEM培養基(含胎牛血清、高糖)制備為單細胞懸液。取淋巴細胞分離液,緩慢滴加細胞懸液,采用密度梯度離心法2 000 r/min離心20 min,用細吸管吸取中間霧狀層細胞置于另一離心管中,用培養液重懸,1 500 r/min離心5 min,吸棄上清,用貼壁培養基重懸,計數后接種于用多聚賴氨酸預先包被的容器中,6 h后棄培養基,換用無血清神經元專用培養基,在37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后用于實驗。

1.5秦艽醇提物血清及正常大鼠血清制備 SD大鼠分為正常組(12只)、秦艽醇提物低劑量組(6只)和秦艽醇提物高劑量組(12只),分別灌胃等體積生理鹽水、0.5 g/kg秦艽醇提物和2 g/kg秦艽醇提物,每天灌胃2次,連續灌胃3 d,末次灌胃2 h后麻醉大鼠,進行腹主動脈采血。血液37 ℃靜置2 h,4 ℃ 4 000 r/min離心10 min,分離血清,同組大鼠血清混合,獲得正常大鼠血清和秦艽醇提物低、高劑量大鼠含藥血清,56 ℃水浴滅活30 min,分裝保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.6DRGn細胞分組與給藥 將培養的DRGn細胞分為對照組、脂多糖組、秦艽醇提物低、高濃度組及SIRT1抑制組。除對照組外,其他組培養基中均先加入終濃度為100 ng/ml的脂多糖作用24 h。然后對照組與脂多糖組均加入10%正常大鼠血清,秦艽醇提物低、高濃度組分別加入秦艽醇提物低、高劑量大鼠含藥血清,SIRT1抑制組加入秦艽醇提物高劑量大鼠含藥血清和98 nmol/L煙酰胺。

1.7CCK-8測定DRGn細胞活力 用神經元專用培養基將DRGn細胞調整為1×105個/ml,每孔100 μl接種96孔板,按1.6中分組給藥,培養24 h,替換神經元專用培養基,每孔加10 μl CCK-8試劑,2 h后用酶標儀(450 nm)檢測吸光度(A值),并計算細胞活力,細胞活力(%)=(A給藥-A空白)/(A對照-A空白),A空白為只有培養基、CCK-8溶液的孔的吸光度。

1.8流式細胞儀檢測DRGn細胞凋亡 同1.7中細胞培養24 h,棄培養基,將細胞消化、洗滌并用結合緩沖液調整為細胞懸液(1×106個/ml),按Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒說明書,依次加入Annexin Ⅴ-FITC、PI試劑各5 μl,黑暗中孵育1 h,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.9ELISA檢測DRGn細胞培養液中炎癥因子水平 同1.7中細胞培養24 h,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,分離培養液,使用IL-6、IL-18、TNF-α ELISA試劑盒檢測DRGn細胞培養液中IL-6、IL-18、TNF-α水平。

1.10Western印跡檢測DRGn細胞中SIRT1/NF-κB通路相關蛋白表達 培養24 h,棄培養基,加細胞裂解液提取細胞中總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法定量,取蛋白樣品80 μg,點樣十二烷基硫酸鈉(SDS)-瓊脂糖凝膠電泳(AGE),電泳并轉移目的蛋白條帶到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉60 min,加入一抗(兔抗SIRT1,1∶800稀釋;兔抗Ac-NF-κB p65,1∶1 000稀釋;兔抗NF-κB p65,1∶1 000稀釋;兔抗GAPDH,1∶1 500稀釋)孵育過夜,加入二抗(山羊抗兔IgG)室溫孵育60 min,滴加電化學發光(ECL)顯色,掃描圖像并分析條帶灰度。

1.11統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組PWPT的變化 建模前假手術組、模型組、陽性組與給藥組PWPT兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05);給藥前模型組、陽性組、給藥組PWPT較建模前及假手術組均顯著降低(P<0.05);給藥后給藥組PWPT較給藥前、模型組均顯著升高(P<0.05),與陽性組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組不同時間PWPT比較

2.2各組DRGn細胞活力 與對照組相比,脂多糖組DRGn細胞活力顯著降低(P<0.05);與脂多糖組相比,秦艽醇提物低、高濃度組DRGn細胞活力顯著升高(P<0.05);與秦艽醇提物低濃度組相比,秦艽醇提物高濃度組DRGn細胞活力顯著升高(P<0.05);與秦艽醇提物低、高濃度組相比,SIRT1抑制組DRGn細胞活力顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3各組DRGn細胞凋亡情況 與對照組相比,脂多糖組DRGn細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與脂多糖組相比,秦艽醇提物低、高濃度組DRGn細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與秦艽醇提物低濃度組相比,秦艽醇提物高濃度組DRGn細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與秦艽醇提物低、高濃度組相比,SIRT1抑制組DRGn細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表2、圖1。

2.4各組DRGn細胞培養液中炎癥因子水平 與對照組相比,脂多糖組DRGn細胞培養液中IL-6、IL-18、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與脂多糖組相比,秦艽醇提物低、高濃度組DRGn細胞培養液中IL-6、IL-18、TNF-α水平顯著降低(P<0.05);與秦艽醇提物低濃度組相比,秦艽醇提物高濃度組DRGn細胞培養液中IL-6、IL-18、TNF-α水平顯著降低(P<0.05);與秦艽醇提物低、高濃度組相比,SIRT1抑制組DRGn細胞培養液中IL-6、IL-18、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.5各組DRGn細胞中SIRT1/NF-κB通路相關蛋白表達 與對照組相比,脂多糖組DRGn細胞中SIRT1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Ac-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與脂多糖組相比,秦艽醇提物低、高濃度組DRGn細胞中SIRT1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),Ac-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與秦艽醇提物低濃度組相比,秦艽醇提物高濃度組DRGn細胞中SIRT1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),Ac-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與秦艽醇提物低、高濃度組相比,SIRT1抑制組DRGn細胞中SIRT1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Ac-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖2、表3。

表2 各組DRGn細胞活力、凋亡率及細胞培養液中IL-6、IL-18、TNF-α水平比較

1～5:對照組、脂多糖組、秦艽醇提物低濃度組、秦艽醇提物高濃度組、SIRT1抑制組圖2 各組DRGn細胞中SIRT1/NF-κB 通路相關蛋白表達情況

表3 各組DRGn細胞中SIRT1、Ac-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平比較

3 討 論

神經病理性疼痛發病機制復雜,臨床表現多變,可累及各部位的神經系統,是許多神經系統疾病的常見并發癥之一,發病率較高,在普通人群的發病率高達7%,對患者及社會造成很大負擔〔10〕。臨床常采用阿片類藥物治療慢性疼痛,但該藥物的成癮性會嚴重影響患者的生存狀態,而抗炎藥、神經性疼痛調節劑、α-受體阻滯劑、加巴噴丁等雖可在一定程度上緩解患者疼痛,但不良反應大,停藥后復發率高,整體治療效果尚不十分滿意〔11〕。脂多糖是革蘭陰性菌的細胞壁主要成分,能引起各種急慢性炎癥損傷,常用于誘導動物、細胞炎癥損傷。本研究采用脂多糖誘導大鼠DRGn細胞,體外模擬神經病理性疼痛患者神經損傷,結果表明DRGn細胞已被脂多糖誘導出現炎癥損傷。

秦艽是臨床常用中藥資源之一,主要分布在我國西藏、甘肅、青海等高海拔地區,具有極高的藥用價值,藥用歷史長達兩千年,富含生物堿、環烯醚萜苷等成分,具有抗炎、鎮痛等作用〔12,13〕。賈娜等〔14〕研究顯示,秦艽醇提物可降低膠原誘導型關節炎模型小鼠血清中炎癥水平,減輕滑膜炎癥。楊彬等〔9〕研究表明,秦艽醇提物能下調miR-34a表達、上調SIRT1表達,進而上調Ac-p53蛋白表達,下調p53蛋白表達,從而抑制痛風性關節炎大鼠的炎癥、氧化應激反應。本研究建立脊髓損傷模型,表明建模后大鼠出現機械痛覺過敏,秦艽醇提物能減輕脊髓損傷后引起的神經病理性疼痛癥狀。細胞實驗提示秦艽醇提物能減輕脂多糖誘導的DRGn細胞炎癥損傷,但其具體作用機制尚不清楚。

SIRT1是細胞內信號轉導的關鍵靶點,可調控下游因子NF-κB亞單位RelA/p65發生去乙?；?進而抑制NF-κB p65的轉錄活性,減少炎癥因子產生,在炎癥損傷調控中發揮重要作用〔15,16〕。李方等〔17〕研究發現,白藜蘆醇可減輕力竭訓練致腎損傷大鼠的炎癥反應,其機制與提高大鼠腎組織SIRT1表達,降低NF-κB p65蛋白乙酰化修飾水平有關。易亞喬等〔18〕研究表明,加味腦泰方可保護缺氧/復氧損傷海馬神經元,發揮抗血管性癡呆作用,其機制與調控SIRT1/NF-κB炎性相關信號通路有關。本研究提示,SIRT1/NF-κB通路參與脂多糖誘導的DRGn細胞炎性損傷,而秦艽醇提物可激活SIRT1/NF-κB通路。在高濃度秦艽醇提物基礎上,使用SIRT1抑制劑煙酰胺處理DRGn細胞,提示秦艽醇提物可能通過激活SIRT1/NF-κB通路,導致NF-κB p65蛋白乙酰化修飾水平降低,進而降低炎癥反應,減少細胞凋亡,提高細胞活力。

綜上所述,秦艽醇提物可激活SIRT1/NF-κB通路,降低炎癥反應,減輕脂多糖誘導的大鼠DRGn細胞炎性損傷,可能對治療神經病理性疼痛具有一定幫助。但對于其是否通過其他通路發揮治療作用亟待深入探究。