扶金化積丸對環磷酰胺治療Lewis肺癌荷瘤小鼠的化療增敏作用及機制

夏小軍 雷旭東 段赟 陳浩方 郭炳濤 馬駿 趙文秀 李文基

(1甘肅省腫瘤醫院中西醫結合腫瘤防治中心,甘肅 蘭州 730050;2甘肅中醫藥大學藥理教研室)

肺癌是最常見的致人死亡的疾病之一,其發病率逐年上升〔1〕。據報道,2018年全球新增肺癌病例209萬例,位于所有癌癥之首〔2〕。肺癌通常分為兩大類,約15%的病例為小細胞肺癌,而85%為非小細胞肺癌。由于肺癌早期無明顯的臨床癥狀及缺少精準有效的診斷方法,大多數肺癌病人確診時已處于中晚期并伴隨轉移,從而錯過最佳治療機會〔3〕。目前化療結合靶向治療可作為肺癌的一線治療方法。然而,肺癌患者5年生存率仍低于20%〔4〕。環磷酰胺(CTX)是一種廣泛應用于腫瘤治療的化療藥物〔5〕,其抗腫瘤機制是通過抑制DNA合成殺死腫瘤細胞,但同時可引起一些副作用,如白細胞減少、骨髓抑制、免疫抑制等〔6〕。中醫藥治療肺癌具有來源廣、成本低、不良反應少、靶點多等諸多優勢。中藥復方對肺癌療效顯著,可有效緩解化療引起的免疫抑制〔7〕。目前,中藥復方開發與應用已成為腫瘤研究的熱點。本研究探討中藥復方扶金化積丸對環磷酰胺治療Lewis肺癌荷瘤小鼠的化療增敏作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1儀器 全自動血液分析儀(上海涵飛醫療器械有限公司);包埋機(浙江省金華市科迪儀器);顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司);電子天平(慈溪市天東衡器廠)。

1.2藥品與試劑 扶金化積丸(甘肅省腫瘤醫院甘肅省醫學科學研究院提供,批號20190325)。RPMI1640培養基(美國Hyclone公司,批號:AE24464298);0.25%胰蛋白酶(上海翊圣生物科技有限公司,批號:T3926890);胎牛血清(美國Life Technologies Corporation公司,批號:42G327016);小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司,批號:1906M);小鼠干擾素(IFN)-γ試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司,批號:1906M);小鼠白細胞介素(IL)-2試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司,批號:1906M);中性樹膠(北京索萊寶科技有限公司,批號:G8590);蘇木素(北京索萊寶科技有限公司,批號:G1080);基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體(美國Proteintech公司,批號:0066523);核因子(NF)-κB抗體(美國Gene Tex公司,批號:41556)。

1.3細胞株 Lewis細胞株購自和元生物技術(上海)股份有限公司。

1.4動物 C57BL/6小鼠,40只,雄性,體質量(20±2)g,由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供,動物生產許可證號:SCXK(甘)2015-0001;合格證號:0000952。

1.5藥液配制 扶金化積丸:用生理鹽水配制成濃度為0.087 5 g/ml的藥液,備用。注射用CTX:用生理鹽水配制成濃度為1 mg/ml的藥液,備用。

1.6荷瘤小鼠模型的建立、分組及給藥 將Lewis細胞株于RPMI1640培養基(含10%胎牛血清、1% 雙抗)中培養,0.25%胰酶(含乙二胺四乙酸、酚紅)消化,調整細胞濃度約為2×106/ml。以C57BL/6小鼠為研究對象,右腋皮下接種細胞懸液0.2 ml/只,共40只,制成Lewis荷瘤小鼠模型。接種約1 w后,待腫瘤長至粒徑0.5 cm時,將其隨機分成荷瘤對照組、扶金化積丸組、CTX組、扶金化積丸+CTX(聯合)組,8只/組,另取8只小鼠作空白對照。分組后除正常組和荷瘤對照組灌胃等體積生理鹽水外,扶金化積丸組灌胃1.749 g/kg(相當于臨床人用量30倍)扶金化積丸藥液,CTX組腹腔注射20 mg/kg(相當于臨床人用量的3.3倍)CTX藥液,聯合組同時灌胃扶金化積丸藥液和CTX藥液。每天一次,共計14 d。停藥1 h后,稱定小鼠體質量,眼球采血。采血后小鼠脫頸椎處死,取瘤體、胸腺及脾臟待測。

1.7瘤重、瘤體積及抑瘤率 用游標卡尺測量瘤體長、短徑,稱重并記錄。參照下列公式計算瘤體體積及抑瘤率:瘤體體積=長徑×短徑2。抑瘤率(%)=(荷瘤對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量)/荷瘤對照組平均瘤質量)×100%。

1.8臟器指數 稱量胸腺及脾臟重量,并按如下公式計算器官指數:器官指數(mg/g)=〔器官濕重(mg)/體質量(g)〕×100%。

1.9血常規 采用全自動血液分析儀進行血細胞計數及血紅蛋白(HGB)濃度檢測。

1.10血清細胞因子TNF-α、IL-2、IFN-γ含量的檢測 按照試劑盒說明書,用酶聯免疫吸附試劑盒檢測荷瘤小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-2、IFN-γ含量。

1.11瘤組織病理學檢測 瘤組織在10%甲醛溶液中固定24 h,于包埋盒中用流水清洗30 min,不同濃度酒精(由低到高)脫水,二甲苯透明瘤組織,將已透明瘤組織于溶蠟箱浸蠟包埋成塊,切成薄片,脫蠟水化,蘇木素-伊紅染色,中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察。

1.12免疫組化檢測瘤組織中NF-κB和MMP-9的表達 取瘤組織,10%甲醛固定,石蠟包埋,制作瘤塊切片,隨后經脫蠟、水化,自來水沖洗,檸檬酸鈉加熱修復抗原,3%過氧化氫孵育封閉內源性過氧化物酶,磷酸鹽緩沖液漂洗,依次給予一抗(1∶200)、二抗稀釋液分別進行孵育,孵育結束并用磷酸鹽緩沖液漂洗后再進行二氨基聯苯胺(1∶20)顯色,觀察可見棕黃色時終止顯色反應,再用蘇木素進行復染約1 min,不同濃度酒精(由低到高)脫水,中性樹膠封片,光學顯微鏡拍照,運用圖像分析軟件對瘤體中NF-κB、MMP-9表達進行分析。

1.13統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1對荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響 與荷瘤對照組比較,扶金化積丸組、CTX組及聯合組荷瘤小鼠瘤重及瘤體體積均顯著減小(P<0.01,P<0.001),抑瘤率分別達19.26%、22.32%、30.19%;與CTX組比較,聯合組瘤重、瘤體體積均顯著降低(P<0.05)。提示聯合用藥的抑瘤效果優于單獨使用CTX。見表1。

2.2對荷瘤小鼠血常規的影響 與荷瘤對照組相比,扶金化積丸組紅細胞計數(RBC)、白細胞計數(WBC)、血小板(PLT)數目及HGB濃度顯著升高(P<0.001),聯合組WBC數目顯著上升(P<0.001);與CTX組比較,扶金化積丸組及聯合組RBC、WBC、PLT數目及HGB濃度顯著升高(P<0.01,P<0.001)。見表1。

表1 扶金化積丸聯合CTX對荷瘤小鼠瘤重及瘤體積及血常規的影響

2.3對荷瘤小鼠臟器指數的影響 與正常組比較,荷瘤對照組胸腺指數顯著下降(P<0.001),而脾臟指數顯著上升(P<0.001)。與CTX組比較,扶金化積丸組及聯合組胸腺、脾臟指數均顯著增大(P<0.001),提示CTX抗腫瘤時可抑制荷瘤小鼠免疫,而扶金化積丸可緩解其對免疫器官的抑制作用。見表2。

2.4對荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2、IFN-γ含量的影響 與荷瘤對照組比較,扶金化積丸組、聯合組血清中TNF-α、IL-2、IFN-γ含量顯著升高(P<0.05,P<0.01),CTX組TNF-α含量顯著升高(P<0.05);與CTX組比較,扶金化積丸組IL-2含量顯著升高(P<0.001),聯合組TNF-α、IL-2含量顯著升高(P<0.05,P<0.001)。見表2。

2.5對荷瘤小鼠瘤組織形態的影響 荷瘤對照組腫瘤細胞形態結構穩定,核固縮較少,偶見壞死,瘤組織內血供充盈;扶金化積丸組有明顯壞死,壞死區域較大,并伴出血情況,出現細胞凋亡;CTX組有散在出血,腫瘤細胞大小不均,胞質被成片染成紅色且顏色較深;聯合組腫瘤細胞排列不緊密,壞死及凋亡現象增強。見圖1。

2.6對瘤組織中NF-κB、MMP-9表達的影響 與荷瘤對照組比較,扶金化積丸組、CTX組及聯合組荷瘤小鼠瘤體中NF-κB、MMP-9表達均顯著降低(P<0.01,P<0.001);與CTX組比較,聯合組與扶金化積丸組NF-κB、MMP-9表達略有回升,但無統計學意義(P>0.05)。見圖2、見表3。

表2 扶金化積丸聯合CTX對荷瘤小鼠臟器指數及血清中TNF-α、IL-2、IFN-γ含量影響

圖1 扶金化積丸聯合CTX對荷瘤小鼠腫瘤細胞形態的影響(免疫組化染色,×200)

圖2 扶金化積丸聯合CTX對瘤體中NF-κB、MMP-9表達的影響(免疫組化染色,×200)

表3 扶金化積丸聯合CTX對瘤組織中NF-κB、 MMP-9表達的影響

3 討 論

CTX被廣泛應用于各種腫瘤的治療。但由于毒性和免疫系統損害,其臨床應用受到了極大的限制。因此,很有必要研發一種輔助治療方法來減少CTX的不良副作用并增強其療效。中藥復方由于其獨特的優勢,如提高生存率、抑制腫瘤生長、緩解術后癥狀和并發癥等,長期以來被用于非小細胞肺癌的治療〔8〕。研究顯示,中藥復方聯合化療比單純化療更能有效抑制Lewis肺癌的生長和轉移〔9〕。本研究結果顯示,扶金化積丸可有效增強CTX對Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用并緩解CTX引起的免疫抑制。扶金化積丸是根據祖國中醫中藥辨證施治的理論研制出的純中藥制劑,系研制者經數十年的臨床實踐而擬定的驗方,用于肺癌的臨床治療。處方組成:西洋參20 g,黃芪30 g,岷當歸15 g,麥門冬10 g,五味子10 g,女貞子10 g,旱蓮草10 g,山萸肉15 g,雞血藤10 g,百合15 g,龍葵10 g,川芎10 g,莪術10 g,玄參10 g,浙貝母10 g,生牡蠣10 g,薏苡仁15 g,山楂10 g。方中主藥西洋參補氣養陰、清熱生津;輔藥黃芪補氣固表;岷當歸補血止血;雞血藤行血補血;生脈散(《內外傷辨惑論》西洋參、麥門冬、五味子)、百合養陰潤肺、生津止咳;二至丸(《醫便》女貞子、旱蓮草)、山萸肉補益肝腎、滋陰止血;佐藥消瘰丸(《中醫方劑臨床手冊》玄參、浙貝母、生牡蠣)清熱化痰、軟堅散結;龍葵散瘀消腫、清熱解毒;莪術、川芎活血行氣止痛;使藥薏苡仁滲濕健脾;山楂散瘀化積、助運脾胃。諸藥合用,對因痰、瘀、毒而致氣陰兩虛的肺積,可奏益氣養陰、扶正祛邪之功效。胸腺和脾臟分別是重要的初級和次級淋巴器官。脾臟主要產生成熟的淋巴細胞,包括Th型和Tc型淋巴細胞。早先的研究顯示,CTX可引起胸腺和脾臟指數下降〔9〕。本研究結果顯示,扶金化積丸處理后可有效提高小鼠胸腺和脾臟指數。RBC、WBC、PLT及HGB起源于骨髓并分布于血液中。化療后外周血中RBC、WBC、PLT數目及HGB濃度的下降反映了腫瘤患者的骨髓抑制。與之前報道相一致的〔10〕,本研究發現,CTX可導致小鼠外周血中RBC、WBC、PLT數目及HGB濃度的下降,而給予扶金化積丸可有效減輕CTX引起的上述改變。

血清細胞因子在免疫系統調節宿主防御中起著重要作用。IL-2對應答性T細胞增殖起促進作用,IFN-γ可抑制腫瘤細胞生長并誘導凋亡〔11,12〕。研究表明,人參漿果多糖可通過上調TNF-α和IFN-γ誘導有效的宿主保護性免疫反應〔13〕。本研究結果提示,扶金化積丸可增強小鼠的免疫防御功能。

NF-κB作為一個重要的轉錄因子,廣泛參與到細胞凋亡、炎癥反應、病毒復制和各種自身免疫性疾病過程中〔14〕。在非小細胞肺癌中,MMP-9的活性與遠處轉移呈正相關。此外,研究顯示MMP-9高表達可作為腫瘤分期及不良預后的一個危險因素〔15〕。本研究結果表明,扶金化積丸、CTX單獨或二者聯合應用均可有效抑制瘤組織中NF-κB和MMP-9的表達水平,從而發揮抗腫瘤作用;但是聯合應用并沒有呈現出更佳的效果。

綜上所述,扶金化積丸可增強CTX對Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用,其作用機制與減輕CTX引起的機體免疫抑制有關。