蔥白提取物對高脂血癥大鼠SREBP2/PCSK9信號通路和線粒體功能的影響

馮云霞 張維麗 謝沛霖 朱旭 趙曉雯

(武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院創(chuàng)面修復與周圍血管科,湖北 武漢 430022)

高脂血癥(HLP)指血脂水平過高引起的脂質代謝紊亂疾病,長期患病會導致動脈硬化、血栓、肝損傷和心血管疾病等的發(fā)生且HLP的發(fā)病率呈逐年升高趨勢〔1,2〕。目前,降脂藥物主要包括他汀類、煙酸、膽汁酸螯合劑和膽固醇吸收抑制劑等,雖然這些藥物起效快也比較方便,但大都存在不良反應,常常會引起胃腸道不適和肝損傷等〔3,4〕,因此尋找能夠有效治療HLP且副作用小的特效藥具有重要意義。中醫(yī)藥治療HLP具有悠久的歷史,且具有一定的優(yōu)勢,療效好、治愈率高、無毒副作用〔5〕。蔥白提取物(FOB)是提取自小蔥白莖中的活性成分,研究表明,FOB具有抗心肌缺血、抗炎、抗氧化、降低血脂等作用〔6〕。但關于FOB降低血脂的具體機制還不清楚,因此本研究通過灌胃脂肪乳構建HLP大鼠模型,探討FOB對線粒體功能的影響及治療HLP的機制,為臨床治療HLP提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物 36只7周齡SPF級雄性SD大鼠,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0104,動物合格證號:430727211101663156,設施使用證號:430727215 785211216。飼養(yǎng)條件:溫度22～26 ℃,相對濕度50%～60%,自行攝食和飲水。

1.2主要試劑及儀器 FOB購自武漢市第一醫(yī)院,戊巴比妥鈉購自sigma merck,豬油購自展藝,膽固醇、膽酸鈉、甲基硫氧嘧啶、吐溫-80、丙二醇瑞舒伐他汀鈣購自阿拉丁,總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)生化試劑盒購自深圳邁瑞,無水乙醇、碳酸鋰、冰醋酸、甲醛、異丙醇、氯仿、戊二醛、丙酮、檸檬酸三鈉購自國藥,伊紅、蘇木素購自碧云天,中性樹脂購自源葉,飽和油紅O染色液、甘油明膠封片劑購自Servicebio,OCT包埋劑購自Sakura,Trizol購自ambion,SYBR FAST實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)Master Mix購自KAPA Biosystems,反轉錄試劑盒購自TAKARA,蛋白質Marker購自Helix,十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨、Tween-20、放射免疫沉淀(RIPA)組織細胞快速裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶購自solarbio,聚偏氟乙烯(PVDF)轉移膜、化學發(fā)光試劑購自millipore,兔抗低密度脂蛋白受體(LDLR)、前蛋白轉化酶枯草溶菌素(PCSK)9、固醇調節(jié)元件結合蛋白(SREBP)2、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自bioswamp,鋨酸購自TedPella,Inc,醋酸鈾購自默克,環(huán)氧樹脂812、硝酸鉛購自SPI,活性氧(ROS)檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒購自beyotime,胎牛血清購自Gibco,DMEM購自Hyclone,大鼠全血單個核細胞分離液 KIT購自TBD。全自動生化分析儀購自深圳邁瑞,正置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡購自徠卡,冷凍切片機購自Thermo,熒光定量PCR儀、電泳儀購自Bio-Rad,酶標儀購自雷勃,全自動化學發(fā)光分析儀購自上海天能,透射電鏡購自日立,流式細胞儀購自艾森。

1.3模型構建及鑒定 SD大鼠飼養(yǎng)7 d后,隨機挑選6只作為正常組,其余30只構建HLP模型,連續(xù)灌胃脂肪乳(膽固醇10%、豬油20%、膽酸鈉2%、甲基硫氧嘧啶1%、20%吐溫-80、丙二醇30%、加水至100%)4 w,結束后眼眶采血并分離血清進行模型鑒定。全自動生化分析儀檢測血液中TC和TG含量。

1.4實驗分組及處理 將灌胃脂肪乳的30只大鼠隨機分成模型組、FOB低、中、高劑量組、瑞舒伐他汀組,每組6只。其中正常組和模型組不做處理,普通飼料飼養(yǎng);FOB低、中、高劑量組分別灌胃FOB 25、50、100 mg/kg,連續(xù)4 w;瑞舒伐他汀組灌胃瑞舒伐他汀100 mg/kg,連續(xù)4 w。灌胃結束后,用3%戊巴比妥鈉麻醉腹腔,腹主動脈取血,取肝臟。

1.5生化檢測血清中血脂含量 全自動生化分析儀檢測血清中TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織形態(tài)變化 切取合適大小固定好的肝組織,脫水浸蠟包埋,切片厚度3 μm左右,烤片后按照HE染色步驟進行染色。顯微鏡拍照。

1.7油紅O染色觀察各組肝組織脂質沉積 冷凍切片干燥30 min,4%中性甲醛4 ℃固定10 min,蒸餾水充分洗滌,60%異丙醇浸洗;油紅O染液避光10 min,60%異丙醇分化至間質清洗;蒸餾水洗;蘇木素染核3～5 min,蒸餾水洗3 min,甘油明膠封片,顯微鏡觀察結果并拍照。

1.8qPCR檢測各組肝組織相關基因mRNA表達 Trizol法提取組織總RNA,利用反轉錄試劑盒合成cDNA,進行PCR擴增。擴增體系:SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μl,上下游引物各0.5 μl,cDNA模板1 μl,ddH2O8μl。反應程序:預95 ℃變性3 min,95 ℃ 5 s,56 ℃ 10 s,72 ℃ 25 s,共40個循環(huán)。引物序列(5′-3′)為,LDLR上游:TTGGCTATGAGTGCCTATG、下游:GCAGAAACCCTATGGAACC,204 bp;PCSK9上游:GCTTCTTGGTGAAGATGAGC,下游:CCACCTGGCTACTTCCG,180 bp;SREBP2上游:CAATGTCAGCGGCACTAC,下游:GGAACACCTTGCGGTATG,233 bp;線粒體基因NADH脫氫酶(ND)1上游:GAATCCCCTTACCAATACC、下游:AGGAGGACGGATAAGAGGA,208 bp;線粒體融合蛋白(mfn)1上游:GAATAATCGTTGGGATGCT,下游:AACTCCTGTAATCTTGCCTGA,246 bp;mfn2上游:TGTCTTGAAATGCGGGAA,下游:CTTGAGGACAAC TGGGGA,213 bp;神經(jīng)萎縮蛋白(OPA)1上游:TGCTTGGGAGACCCTACA,下游:AAGTAGATGGCTGCGTCC,225 bp;線粒體動力相關蛋白(Drp)1上游:ATTGACATCTTGACCGCC,下游:TCCTGTGTGC TGTAGTTGC,191 bp;GAPDH上游:CAAGTTCAAC GGCACAG,下游:CCAGTAGACTCCACGACA,138 bp;β-actin上游:TTACTGCCCTGGCTCCTAG,下游:CGTACTCCTGCTTGCTGATC,262 bp。PCR引物均由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。用ND1代表mtDNA的拷貝數(shù),ND1、mfn1、mfn2、OPA1、Drp1均以β-actin為內參,LDLR、SREBP2、PCSK9以GAPDH為內參,用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.9Western印跡檢測肝組織LDLR、PCSK9和SREBP2蛋白表達 組織剪碎后加入裂解液,勻漿后4 ℃ 11 500 r/min離心15 min,取上清進行蛋白質定量。12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離目的蛋白,濕轉法將蛋白轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜,加入一抗(稀釋比均為1∶1 000),與膜室溫孵育1 h,洗膜3次后加入二抗(稀釋比1∶10 000),與膜室溫孵育1 h,將膜置于暗室后加入發(fā)光液混勻,置于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測,用TANON GIS軟件讀取條帶灰度值。

1.10透射電鏡觀察肝組織線粒體 大鼠麻醉后迅速取材,2.5%戊二醛4 ℃固定30 min以上,PBS清洗3次后,1%鋨酸固定1 h,PBS清洗3次后梯度脫水;丙酮和環(huán)氧樹脂812按照1∶1的比例40 ℃半浸透6 h,純環(huán)氧樹脂812 40 ℃全浸透4 h,包埋板包埋,加入包埋劑,置于烤箱聚合,程序為40 ℃ 4 h,50 ℃ 2 h,90 ℃ 12 h以上;60 nm超薄切片后,醋酸鈾避光染色20 min,雙蒸水洗3次,吸干后用枸櫞酸鉛避光染色15 min,雙蒸水洗去鉛液,濾紙吸干,透射電鏡觀察并拍照。

1.11流式檢測ROS 分離大鼠外周血單個核細胞,按照1∶1 000的比例用無血清培養(yǎng)液稀釋ROS熒光探針2,7-二氯熒光素二氫二乙酸酯(DCFH-DA),使終濃度為10 μmol/L。使細胞懸浮于1 ml稀釋好的DCFH-DA中,細胞濃度為1×106/ml,5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。每隔3 min顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌3次后,500 μl PBS重懸,細胞濃度為1×106/ml,上流式細胞儀檢測ROS。使用NovoCyte軟件進行分析。

1.12線粒體膜電位 取1×106個細胞,重懸于0.5 ml細胞培養(yǎng)液中。加入0.5 ml JC-1染色工作液,混勻后在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。1 500 r/min 4 ℃離心3 min,棄上清;用JC-1染色緩沖液洗滌2次,加入1 ml JC-1染色緩沖液重懸細胞,1 500 r/min 4 ℃離心3 min,棄上清,重復兩次后加入400 μl JC-1染色緩沖液重懸細胞,上機檢測,使用NovoCyte分析軟件進行分析。

1.13統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8.0和SPSS 25.0進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1模型鑒定 造模結束后,與正常組相比,模型組TC〔(3.56±0.47) vs (7.68±0.76)mmol/L〕和TG〔(0.85±0.09) vs (1.53±0.14)mmol/L〕水平均顯著升高(P<0.01),表明模型構建成功。

2.2FOB降低HLP大鼠血清脂質含量 與正常組相比,模型組TC、TG、LDL-C水平顯著升高,HDL-C水平顯著降低(P<0.01);與模型組相比,FOB低、中、高劑量組和瑞舒伐他汀組TC、TG、LDL-C水平均顯著降低,HDL-C水平顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組血清脂質含量及肝組織LDLR、PCSK9和SREBP2 mRNA表達水平比較

2.3FOB調節(jié)HLP大鼠SREBP2/PCSK9信號通路 如表1、表2、圖1所示,與正常組相比,模型組LDLR mRNA和蛋白表達水平顯著降低,PCSK9、SREBP2 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,FOB低劑量組LDLR mRNA水平升高但無統(tǒng)計學差異(P>0.05),PCSK9、SREBP2 mRNA水平顯著降低(P<0.01),LDLR蛋白表達水平顯著升高(P<0.01),PCSK9蛋白表達水平降低但無統(tǒng)計學差異(P>0.05),SREBP2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01);FOB中、高劑量組和瑞舒伐他汀組LDLR mRNA和蛋白表達水平顯著升高,PCSK9、SREBP2 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)。

表2 各組肝組織LDLR、PCSK9和SREBP2蛋白相對表達 水平比較

1～6:正常組、模型組、FOB低、中、高劑量組、瑞舒伐他汀組圖1 各組肝組織LDLR、PCSK9和 SREBP2蛋白表達

2.4FOB降低HLP大鼠肝臟脂質沉積 正常組肝臟油紅O染色未見脂質沉積,模型組可見大量紅色脂滴,脂質沉積增加,FOB低、中、高劑量組較模型組脂質沉積均減少,且呈劑量依賴性,FOB高劑量組脂質沉積最少,瑞舒伐他汀組可見少量脂質沉積。見圖2。

2.5FOB改善HLP大鼠肝組織形態(tài) 如圖2所示,正常組肝組織染色均勻,細胞結構完整,胞核清晰,肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列,未見炎性細胞浸潤。模型組肝組織腫大變性,肝細胞板排列紊亂,細胞質間出現(xiàn)脂肪滴空泡,大量炎性細胞浸潤,可見脂肪性病變。灌胃后上述病理改變均有所改善。FOB低劑量組肝細胞板排列紊亂,空泡減少,但仍可見脂滴空泡,FOB中、高劑量組肝組織未見細胞變性,偶見脂肪空泡,但細胞板排列清晰,細胞結構清晰完整,表明不同劑量FOB對肝臟損傷修復的程度不同。瑞舒伐他汀組肝細胞板排列整齊,胞核清晰,極少量脂滴空泡。

2.6FOB緩解HLP大鼠肝組織線粒體損傷 如圖3所示,正常組線粒體結構完整,嵴結構清晰且緊密排列;模型組線粒體腫脹,嵴模糊、稀疏、斷裂;與模型組相比,FOB低劑量組線粒體腫脹稍減輕,嵴稍清晰,可見少量嵴斷裂,FOB中、高劑量組和瑞舒伐他汀組線粒體腫脹程度均顯著減輕,線粒體嵴結構清晰且緊密排列。

2.7FOB降低HLP大鼠活性氧及線粒體膜電位 如圖4、表3所示,與正常組相比,模型組ROS水平顯著升高,線粒體膜電位顯著降低(P<0.01);與模型組相比,FOB低、中、高劑量組和瑞舒伐他汀組ROS水平顯著降低,線粒體膜電位顯著升高(P<0.01)。

圖2 各組肝組織(×200)

圖3 透射電鏡觀察各組肝組織線粒體微結構(×12 000)

2.8線粒體DNA拷貝數(shù)(mt-ND1)及mfn1、mfn2、OPA1、Drp1 mRNA表達 如表3所示,與正常組相比,模型組mt-ND1及mfn1、mfn2、OPA1 mRNA表達水平均顯著降低,Drp1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,FOB低劑量組mt-ND1及mfn1和mfn2 mRNA表達水平均升高但無統(tǒng)計學差異(P>0.05),OPA1 mRNA表達水平顯著升高,Drp1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01);FOB中、高劑量組和瑞舒伐他汀組mt-ND1及mfn1、mfn2、OPA1 mRNA表達水平均顯著升高,Drp1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)。

表3 各組ROS、線粒體膜電位及mt-ND1和mfn1、mfn2、OPA1、Drp1表達水平的比較

3 討 論

HLP的發(fā)病率逐年升高,且發(fā)病年齡趨于年輕化〔2〕。HLP表現(xiàn)為血液中TC、TG、LDL-C水平的升高和HDL-C水平的降低〔7〕。本研究模型鑒定結果表明模型構建成功。研究表明,FOB具有調節(jié)血脂的作用〔6〕,本研究結果與前人研究結果一致。同時,FOB能夠減少肝臟中脂質沉積,改善肝臟組織形態(tài),說明FOB對治療HLP具有較好的效果。

調節(jié)脂質代謝相關基因的表達對治療HLP具有重要作用。PCSK9是由肝細胞合成的絲氨酸蛋白酶,能夠與LDL-R結合,使受體降解加速,導致受體數(shù)量減少,從而升高LDL-C水平,促進脂肪代謝相關疾病的發(fā)生〔8〕。抑制PCSK9的表達成為一種新型降脂策略。SREBP2是調控膽固醇代謝的關鍵因子,能夠調控PCSK9表達〔9〕。王春梅等〔10〕發(fā)現(xiàn),五味子復合提取物通過降低SREBP2表達調節(jié)HLP大鼠的血脂水平。本研究結果與之一致,表明FOB能夠通過調控SREBP2/PCSK9信號通路發(fā)揮降低血脂的功能。

線粒體是細胞能量的代謝中心,研究表明,線粒體發(fā)生功能障礙時發(fā)生HLP的風險會增加〔11〕。線粒體的融合和分裂是實現(xiàn)線粒體功能的基礎,對于維持線粒體形態(tài)、功能和結構的穩(wěn)定至關重要〔12〕。融合分裂運動失衡會破壞線粒體的網(wǎng)狀結構,從而促進細胞的凋亡〔13〕。融合的發(fā)生取決于外膜上的mfn1、mfn2和內膜上的OPA1。當線粒體發(fā)生接觸時,mfn1和mfn2會形成二聚體連接線粒體,然后OPA1介導線粒體內膜發(fā)生融合〔14〕。功能受損的線粒體通常OPA1含量很低〔15〕。Drp1屬于動力蛋白超家族,是線粒體分裂的必需蛋白。線粒體分裂時Drp1會從胞質募集至線粒體外膜與外膜蛋白結合完成分裂過程〔16〕。Drp1還會通過磷酸化和泛素化等調節(jié)線粒體的分裂〔17〕。本研究結果表明,FOB可以促進HLP大鼠線粒體的融合,抑制線粒體的分裂,保護線粒體功能。

線粒體是負責能量代謝的主要細胞器,正常的線粒體膜電位更是維持線粒體能量代謝功能的重要條件〔18〕,線粒體在產(chǎn)能時會產(chǎn)生大量的ROS,而ROS過表達會增加線粒體的通透性,損傷線粒體DNA,使線粒體產(chǎn)生氧化損傷〔19〕。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)冬凌草能夠通過抑制氧化應激、提高線粒體膜電位來保護線粒體維持肝功能〔20〕,與本研究結果一致。mtDNA拷貝數(shù)指mtRNA分子復制的數(shù)量,mtDNA拷貝數(shù)對維持線粒體功能有著重要的作用〔21〕。過度的氧化應激損傷即ROS水平的顯著升高會導致mtDNA拷貝數(shù)的減少〔22〕。以上表明FOB具有改善線粒體功能的作用。

綜上所述,FOB具有降低血脂,減少脂質沉積等作用,其機制可能與改善線粒體功能、調節(jié)SREBP2/PCSK9信號通路有關。