雄性激素誘導的長鏈非編碼RNA LINC01126促進前列腺癌細胞增殖、凋亡及Warburg效應

紀金宏 馬曉倩 劉新雅 何昆侖

(衡水市人民醫院,河北 衡水 053000)

前列腺癌(PCa)具有地域性和種族性。在西方國家,尤其是歐美等發達國家中的男性最為常見的,同時也是較為嚴重的一種疾病,其死亡率在所有癌癥中位居前1/3〔1〕;PCa在亞洲的發病概率較西方國家發病概率小,但是近年來PCa的病例也在逐年增加〔2〕。在我國PCa多為晚期,已發生轉移。常見給予抗雄激素治療,具有一定的治療效果,但在治療1年后幾乎全部患者均會轉變為去勢抵抗性PCa,至今尚無較好的解決方案。PCa早期無特異性特征,導致大部分患者一經發現已為晚期,因此早期診斷對于治療至關重要〔3,4〕。長鏈非編碼 RNA存在于細胞核與細胞質中,LINC01126是其成員之一,研究發現〔5〕,在人體基因組中有近6萬個lncRNA基因的表達。已有研究證實〔6〕,lncRNA在基因轉錄調節等過程中具有重要作用,還可通過順式/反式調控其他基因水平。除此之外〔7〕,lncRNA在多種腫瘤中均存在異常表達,可通過調控細胞的增殖、轉移等過程參與腫瘤的產生及發展。導致腫瘤轉移產生的主要原因是促進及抑制癌細胞轉移的因素水平失衡,癌細胞能量代謝模式(Warburg效應解)的開啟帶來的相關效應(癌細胞轉移促進基因的激活)在打破這種失衡中發揮了重要作用,但具體機制目前尚未完全了解。本研究雄性激素誘導的長鏈非編碼RNA LINC01126促進PCa細胞增殖、凋亡及Warburg效應。

1 材料和方法

1.1實驗試劑 LINC01126、雄激素受體(AR)引物序列(上海晶能生物公司);聚合酶鏈反應(PCR)儀(南京康維達生物公司,型號:QuantStudio 3);噻唑藍(MTT)溶液(武漢普諾賽生命科技公司);結晶紫溶液(上海尚寶生物公司);流式細胞儀(北京煥彩元合科技公司,型號:BD FACSCanto Ⅱ);酶標儀(濟南霍爾德電子科技公司,型號:HED-SY96S)。

1.2細胞來源及培養 人PCa細胞DU145、PC3、LNCaP、IA8及正常前列腺細胞RWPE-1均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。DU145、PC3、LNCaP、IA8用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養,所有細胞均在37 ℃、5%CO2條件下培養。待細胞生長至80%時胰酶消化、離心、重懸、傳代,取第3代進行實驗。

1.3組織標本來源 PCa組織、癌旁組織、肝癌組織、乳腺癌組織、胃癌組織、膀胱癌組織、食管癌組織、腎癌組織標本來源于衡水市人民醫院2019年5月至2020年4月收治的上述疾病患者(已經過病理確認),每個疾病取5個腫瘤組織標本,且已經過患者及家屬同意,本研究經過醫院倫理委員會審核批準(批準文號:Y2019-010-18)。

1.4AR載體構建及轉染 AR載體的構建及轉染根據文獻〔8〕進行:載體用T4 DNA Ligase酶連接AR基因與pCDNA3.1+載體進行構建,提取質粒。前1 d將細胞接種至培養基中(無抗生素),融合至80%后,分為空白組、對照組(轉染空載體)及轉染組。將質粒加入24孔板中,稀釋至100 μl為Z液。取1 μl Lipofectamine2000溶解于培養基為L液,Z、L液混合后加到培養板中。4 h后更換培養基,48 h后收樣。

1.5檢測指標

1.5.1實時熒光定量(qRT)-PCR檢測LINC01126、AR水平 取各細胞及剪碎的PCa組織與癌旁組織,加入0.125%胰蛋白酶裂解后,將細胞懸液放于試管中。利用Trizol法檢測提取總RNA,按照Micro RNA反轉錄試劑盒說明書對總RNA進行反轉錄。LINC01126上游引物:5′-AGCGTAAGGGTGGAGAAAGC-3′,下游:5′-CTGAGGTCACCTG CTCTTGG-3′;AR上游引物:5′-ATGGAAGTGCAGTTAGGGCTGG-3′,下游:5′-TCACTGGGTGTGGA AATAGATGGG-3′;內參GAPDH上游引物:5′-TTGATCTTCATGAGCTAGGAGCGAAGGGGA-3′,下游:5′-TGACGGTCAGGTCATGACTATCGGCAATGA-3′。PCR條件:95 ℃ 5 min、95 ℃ 5 s、59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s以上40個循環,72 ℃延伸10 min。以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.5.2MTT測細胞增殖 將LNCaP(4×103)接種至96孔板,上述方法將細胞分為空白組、對照組與轉染組,并給予相應的轉染。待細胞密度至60%時,換液,分別孵育12、24、48 h 后,加入MTT溶液孵育4 h,運用酶標儀檢測光密度(OD)值,并判斷細胞增殖能力。

1.5.3Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 遷移:將LNCaP細胞消化制成懸液,上室加入200 μl細胞(1×105)懸液,將750 μl含10%胎牛血清(FBS)的培養基加入下室,常規培養48 h,取出小室后棄上清,多聚甲醛固定,結晶紫染色,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后于顯微鏡下觀察。侵襲:預先用無血清培養基將Matrigel (50 mg/L)稀釋(1∶4),包被Transwell小室底部膜,4 ℃風干,水化基底膜。其余步驟同遷移實驗。

1.5.4流式細胞儀測凋亡 將LNCaP(1×105/ml)接種至6孔板,培養24 h,胰酶消化后PBS清洗,離心后棄上清。混入500 μl結合緩沖液 重懸。加入 5 μl膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素酶(Annexin Ⅴ-FITC)混勻、 10 μl碘化丙啶(PI)混勻,室溫避光孵育5～15 min,隨即進行流式細胞儀檢測。

1.5.5Warburg效應檢測 葡萄糖攝取:將LNCaP(1×105個/孔)接種于6孔板中,加20 μg/ml PSL,24 h后將培養基補至2 ml,常規培養48 h后收集培養液。以初始細胞葡萄糖量作為空白,制備反應液,混勻后進行水浴反應,酶標儀測吸光度。乳酸生成:空白均以初始細胞為準,配制反應液(樣本、酶工作液、顯色液;0.02 ml∶1 μl∶0.2 ml),混勻后水浴中進行反應,酶標儀測吸光度。

1.6統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行方差分析,兩組間對比采用t檢驗。

2 結 果

2.1LINC01126在不同組織中的表達 與肝癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、腎癌等組織(0.85±0.06、0.82±0.07、0.84±0.06、0.86±0.05、0.83±0.03、0.81±0.08)相比,PCa組織中LINC01126表達明顯較高(1.02±0.03;P<0.001),表明LINC01126在PCa組織中呈現高表達。此后,用PCa組織與癌旁正常組織做了進一步檢查,發現PCa組織中的LINC01126表達水平(1.97±0.14)顯著高于癌旁正常組織(1.00±0.01,P<0.05)。

2.2LINC01126在各細胞中的表達 RWPE-1中LINC01126表達(1.00±0.04)明顯低于在DU145、PC3、LNCaP、IA8中的表達(2.81±0.15、2.79±0.17、3.14±0.16、2.77±0.20;F=250.500,P<0.001)。LNCaP中LINC01126表達顯著高于在PC3、DU145、IA8中的表達(P<0.05)。因此,本文選用LNCaP細胞進行后續實驗。

2.3各組LNCaP細胞LINC01126及AR mRNA比較 空白組與對照組LNCaP細胞中LINC01126、AR表達水平對比無明顯差異(P>0.05)。轉染AR后轉染組LNCaP細胞中AR mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05),提示AR轉染成功。同時,LNCaP細胞中LINC01126水平也隨之增加,與對照組相比差異顯著(P<0.05),提示雄激素增加可誘導LINC01126水平升高,見表1。

2.4各組LNCaP細胞增殖比較 空白組與對照組不同時間點LNCaP細胞的OD值相比均無顯著差異(P>0.05)。轉染組不同時間點LNCaP細胞OD值均顯著高于空白組、對照組(P<0.05),見表1。

2.5各組LNCaP細胞遷移及侵襲比較 空白組與對照組LNCaP細胞遷移及侵襲數量無差異(P>0.05)。轉染組LNCaP細胞遷移及侵襲數量顯著高于空白組、對照組(P<0.05),見表1、圖1。

2.6各組LNCaP細胞凋亡率比較 空白組LNCaP細胞凋亡率〔(6.54±0.58)%〕與對照組〔(6.12±0.64)%〕相比無顯著差異(t=1.191,P=0.261)。轉染組LNCaP細胞凋亡率〔(0.15±0.03)%〕顯著低于對照組(t=22.820,P<0.001),見圖2。

表1 各組LINC01126、AR mRNA水平、OD值、遷移及侵襲數量比較

圖1 各組LNCaP細胞侵襲及遷移(結晶紫染色,×200)

圖2 各組LNCaP細胞凋亡率

2.7各組LNCaP細胞Warburg效應比較 空白組〔(3.26±0.21)、(4.84±0.31)mmol/L〕與對照組LNCaP細胞葡萄糖攝取量及乳酸生成量〔(3.01±0.32)、(4.62±0.43)mmol/L〕比較無統計學差異(P>0.05)。轉染組LNCaP細胞葡萄糖攝取量及乳酸生成量〔(6.42±0.67)、(9.36±0.72)mmol/L〕顯著高于空白組、對照組(t=11.020、14.120,P<0.05)。

3 討 論

研究表明〔9〕,雄性激素是誘導的PCa患者死亡的主要原因。雄激素誘導PCa的主要機制可能是〔10〕:AR基因增加,促進了腫瘤雄性激素增加,從而增加對抗雄激素藥物產生應答;通過改變AR相關作用,使得突變的AR被激活,通過改變相關因子的表達與功能,從而使AR異常活化,促進腫瘤的發展。本研究提示,盡管LINC01126在PCa中特異性表達的機制尚不明確,但LINC01126與PCa病情發展聯系密切。將其轉染至列腺癌細胞中發現,在雄激素受體AR水平升高的同時,LINC01126表達增加,這提示,LINC01126與AR可能存在一定的調控關系,本文進一步研究提示,AR水平的增加通過影響LINC01126表達促進PCa的發展。在浦洪雷等〔11〕的實驗中提出,高表達的LINC01126促進前列腺癌的發展,減少癌細胞凋亡。曾穎科等〔12〕研究中提出,AR受體水平增加會使雄性激素水平增加,AR的表達與PCa細胞的惡性程度呈正相關。胡晶晶等〔13〕研究中提出,雄激素受體AR與長鏈非編碼RNA PCRL存在一定的調控關系,AR通過提高PCRL水平可促進PCa的發展,減少癌細胞凋亡。本研究與上述研究結果相似,因此本文推測,雄性激素可能通過誘導LINC01126水平增加,促進PCa細胞的增殖、侵襲、遷移并抑制凋亡。

Warburg效應是腫瘤代謝異常的表現,促進腫瘤細胞的增殖及轉移〔14,15〕。這種能量代謝方式的轉變受許多復雜因素的調控,主要表現為增強糖酵解作用,抑制線粒體的氧化磷酸化。其中,葡萄糖的極大吸收和乳酸生成是腫瘤Warburg效應的重要特征〔16〕。研究顯示〔17〕,腫瘤將大量乳酸釋放到細胞外時,由于細胞內的乳酸濃度比率發生變化,使得免疫細胞不能釋放自身乳酸,從而使自身乳酸窒息而亡,導致免疫逃逸,從而促進腫瘤轉移。本實驗中給予AR轉染后,LINC01126水平增加同時癌細胞代謝的乳酸生成量及葡萄糖攝取量明顯增加。吳守振等〔18〕研究提出,在PCa中葡萄糖攝取量及乳酸生成量會增加,通過抑制Warburg效應,可抑制癌細胞的活性。張勇等〔19〕在實驗中提出,長鏈非編碼 lncRNA-p21通過增強PCa Warburg效應,促進癌細胞的增殖及遷移能力。本研究與上述研究結果類似,因此本文推測,雄性激素可能是通過誘導LINC01126水平增加后,增強了Warburg效應,從而促進了PCa細胞的增殖、侵襲、遷移能力并減少細胞凋亡。