miR-29a影響eNOS蛋白表達參與血管內皮障礙機制研究

鄒鵬濤，何磊，張方，朱波

南昌大學第二附屬醫院心血管內科，江西南昌 330006

冠心病是心血管疾病中的常見病癥，其病變機制為冠狀動脈出現粥樣病變，最終使個體出現諸如心肌缺血、缺氧或壞死等臨床癥狀[1-2]。全球每年死于冠心病的病例總數近700萬，位居單病種死因之首[3]。miRNA已被多項研究證實參與動植物基因表達調控，主要機制為通過降解靶基因mRNA或調控其蛋白表達影響機體生理機制[4]。miR-29a是miRNA的一員，被證實廣泛參與多種心血管疾病的發生和發展。張建興等[5]研究發現心肌梗死患者血清miR-29a水平顯著高于不穩定型心絞痛患者，提示miR-29a與心肌缺血-再灌注關聯密切。Yang等[6]研究發現結直腸癌患者中miR-29a表達顯著上調，而通過抑制miR-29a的表達可發揮抑制癌細胞遷移和侵襲的作用。Silvis等[7]研究發現炎癥反應促進多種炎癥因子分泌，炎癥因子進一步加重冠狀動脈內皮細胞損傷，加快動脈粥樣硬化進程。關于miR-29a對冠心病患者內皮細胞損傷的研究較多，但對其機制的探索較少，本研究旨在通過體外細胞實驗分析炎癥因子對miR-29a及其對應蛋白表達的影響，以期為冠心病患者的治療提供新的理論參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與材料

原代人臍靜脈內皮細胞及內皮細胞培養基（美國Sciencell公司）、熒光檢測試劑盒、細胞培養箱（美國賽默飛世爾科技公司）、蛋白核酸定量儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）、凝膠成像系統（青島奧特凱美軟控技術有限公司）、蛋白垂直電泳儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司）。

1.2 細胞培養與增殖過程

凍存細胞用37℃水浴融化后，在4℃環境下以3000轉/min離心。在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的改良RPMI-1640培養基中重懸生長。增殖過程選取對數生長期的細胞稀釋至1×103cell/ml。將瓊脂與培養基按1∶9的比例充分混合，加入平板中，放置在室溫下使瓊脂固化，然后接種細胞懸浮液混合物（1.5ml）和等體積的0.5%軟瓊脂。將板置于37℃、5% CO2的培養箱中，培養兩周后，使之生長至合適細胞密度。將腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）及血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）分別加入內皮細胞培養基中進行培養，培養時間為4～48h。

1.3 反轉錄和定量聚合酶鏈反應分析

向收集的培養細胞中加入TRIzovl試劑以提取總RNA。反轉錄試劑盒按照ABI公司（美國）反轉錄試劑盒說明進行操作。cDNA為模版反應體系和條件：體系包含10μl去離子水、1μl寡核苷酸（oligonucleotide，dT）、2μl RNA，16℃條件下孵育30min，在體系內2μl脫氧核糖核苷酸三磷酸、1μl RNA抑制酶、4μl上樣緩沖液42℃孵育30min，85℃加熱5min，迅速冷卻后，置于4℃環境中保存。將得到的樣本進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR），采用TaqMan Universal PCR Master Mix 20μl反應體系，在羅氏（瑞士）LightCycler480儀器上操作，以β-action作為表達檢測的內參。預變性10min；于95℃條件下變性15s，后60℃條件下退火30s，70℃條件下延伸30s，進行40個循環的擴增，β-action上下游引物序列：5'-TCAG GTCATCACTATCGGCAAT-3'，5'-AAAGAAAGGGT GTAAAACGCA-3'。miR-29a上下游引物序列：5'-CC CATCTATGAGGGTTACGC-3'，5'-TTTAATGTCACG CACGATTTC-3'。

1.4 實時定量PCR檢測及蛋白質印跡分析

使用EzOmics one-step qPCR試劑盒對細胞系內皮細胞中的miR-29a及內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表達情況進行檢測，檢測儀器為stratagene Mx3000 pTM型實時定量PCR儀，miR-29a值以U6值作為參照，eNOS值以GAPDH作為參照，分別計算miR-29a及eNOS的表達情況。在37°C條件下以4000轉/min離心5min收集細胞，將細胞（1×106）在250μl放射免疫沉淀測定緩沖液中裂解。通過10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（denatured polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離50μg細胞蛋白，并轉移至聚偏二氟乙烯膜，加入1∶3000稀釋后轉化因子2β（transforming factor 2β，TRA2β）的大鼠抗人單克隆抗體后在4°C下孵育過夜。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline solution，PBS）洗滌3次后將辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗大鼠二抗以1∶3000的稀釋度在室溫下靜置處理30min，洗去所有未偶聯的抗體。使用Western熒光檢測試劑染色，用BandScan 5.0軟件觀測成像光密度。

1.5 統計學方法

采用SPSS 24.0統計學軟件對數據進行分析處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 炎癥因子TNF-α和SAA對細胞miR-29a表達的影響分析

加入TNF-α和SAA并未使miR-21、miR-29b、miR-29c的表達水平出現明顯變化（P>0.05）；但miR-29a的表達水平較對照組顯著提高（P<0.05）；加入TNF-α與加入SAA的細胞系中miR-29a表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1、圖1。

圖1 TNF-α和SAA對細胞miR-29a表達的影響

表1 TNF-α和SAA對細胞miR-29a表達的影響分析（±s）

表1 TNF-α和SAA對細胞miR-29a表達的影響分析（±s）

指標 TNF-α（ng/ml）SAA（U/L） 對照組 t P miR-21 1.05±0.21 1.07±0.15 1.03±0.18 0.635 0.551 miR-29a 2.21±0.26 2.38±0.18 1.04±0.15 0.816 0.236 miR-29b 1.10±0.10 1.09±0.15 1.06±0.11 2.659 0.021 miR-29c 1.12±0.11 1.13±0.15 1.10±0.17 0.165 0.897

2.2 炎癥因子水平及作用時間對miR-29a表達影響的分析

qRT-PCR檢測顯示，隨著加入炎癥因子水平的升高，細胞系中miR-29a表達也呈現明顯的升高趨勢，見表2、圖2。以1.0ng/ml的TNF-α及SAA作為恒定水平進行干預，觀察炎癥因子作用時間對miR-29a表達的影響，結果顯示隨著時間推移，miR-29a表達也呈現明顯的升高趨勢，見表3、圖3。

圖2 炎癥因子水平對miR-29a表達的影響

圖3 時間對miR-29a表達水平的影響

表2 炎癥因子水平對miR-29a表達影響的分析（±s）

表2 炎癥因子水平對miR-29a表達影響的分析（±s）

炎癥因子水平（ng/ml）TNF-α（ng/ml） SAA（U/L） t P 0 1.04±0.15 1.01±0.18 0.516 0.419 1 2.21±0.26 2.38±0.18 0.635 0.411 10 2.59±0.15 2.61±0.16 0.951 0.215 20 2.73±0.11 2.81±0.16 0.669 0.411

表3 時間對miR-29a表達影響的分析（±s）

表3 時間對miR-29a表達影響的分析（±s）

炎癥因子加入時間（h）TNF-α（ng/ml） SAA（U/L） t P 0 2.21±0.26 2.20±0.18 0.441 0.635 4 2.34±0.14 2.41±0.15 0.951 0.236 12 2.46±0.12 2.51±0.11 0.746 0.431 24 2.68±0.18 2.67±0.17 0.635 0.441

2.3 炎癥因子對eNOS蛋白表達水平影響的分析

采用Western blot對TNF-α及SAA通過細胞系作用于eNOS蛋白表達水平影響進行分析，結果顯示，相較于對照組，加入TNF-α及SAA均可導致eNOS蛋白表達的下調，見圖4。

圖4 炎癥因子對eNOS蛋白表達水平的影響

2.4 丹參對miR-29a及eNOS蛋白表達影響的分析

丹參不同劑量、不同作用時間對miR-29a表達水平影響的分析結果顯示，miR-29a表達水平隨著丹參濃度的升高呈降低趨勢；恒定濃度下，隨著時間的推移，miR-29a表達水平呈降低趨勢，見圖5。加入丹參可使eNOS蛋白表達升高，見圖6。

圖5 丹參對miR-29a表達水平的影響

圖6 丹參對eNOS蛋白表達的影響

3 討論

冠心病的發病機制及病因在不同患者中存在較大的差異，患者面臨的臨床風險也存在較大差異[8]。當前臨床上主要將心電圖、心肌損傷標志物用于冠心病的診斷中，但上述檢測方式均存在一定的局限性，冠心病患者的早期診斷難度較大[9]。針對冠心病流行病學的研究指出，近些年冠心病患者的預后呈好轉趨勢，但仍有部分患者在干預后數月或數年后出現急性心肌梗死[10]。目前針對上述現象的研究屬于熱點方向之一，通過篩選心血管時間或死亡高風險患者并進行標志物的分析，對降低冠心病患者病死率具有積極意義。

miRNA主要作用機制為通過降解或翻譯抑制實現對靶基因的負調控，進而起到調控生理機制的作用[11]。人類基因組中約有1881條miRNA前體，影響約60%人類基因組中基因片段的表達，提示miRNA對人體多項生物進程如細胞分化、增殖、凋亡等發揮重要作用[12]。有研究指出，miRNA參與內皮細胞功能調控、平滑肌細胞增生、新生血管形成等進程，同時還影響惡性腫瘤細胞的遷移、凋亡等[13-14]。miR-29a是miRNA家族中的一員，已有研究指出，miR-29a在多種癌組織中呈現過表達狀態，與癌癥的發生、發展有密切聯系[15]；但關于miR-29a對冠狀動脈內皮細胞凋亡及炎癥因子表達的相關研究較少。本研究通過體外細胞實驗，發現加入TNF-α與SAA并未使miR-21、miR-29b和miR-29c的表達水平出現明顯變化，但miR-29a的表達水平較對照組顯著提高，提示TNF-α及SAA可通過影響miR-29a的表達參與機體血管內皮細胞的病變進程。本研究進一步分析劑量及作用時間對miR-29a表達水平的影響，提示隨著炎癥因子水平的增加及作用時間的延長，miR-29a表達量均呈現升高趨勢，進一步證實炎癥因子TNF-α及SAA誘導miR-29a的表達，且這種誘導呈現劑量及時間依賴。

本研究分析炎癥因子對eNOS蛋白表達水平的影響，顯示加用TNF-α及SAA均導致eNOS蛋白表達的下調，與對照組比較差異有統計學意義。魏艷勝等[16]發現eNOS蛋白廣泛參與冠狀動脈內皮細胞損傷進程，而加入谷紅注射液可明顯提高eNOS表達水平，從而提高冠狀動脈內皮細胞的存活率。本研究中炎癥因子的引入使eNOS蛋白表達降低，卻提高miR-29a的表達量，提示miR-29a可通過影響eNOS蛋白的表達參與內皮細胞損傷進程。吳瑩[17]的研究證實eNOS是miR-29a的靶標。另有研究認為miR-29a通過影響eNOS蛋白的表達，在腎間質纖維化、心肌纖維化等病變中發揮重要作用，與本研究結論相似[18]。最后為反向論證本研究的結論，研究中引入血管保護性藥物丹參，加入丹參后可抑制miR-29a的表達，增加eNOS蛋白的表達，提示miR-29a正是通過影響eNOS蛋白的表達參與血管內皮功能變化進程，而使用血管保護性藥物則可特異性降低miR-29a的表達，增加eNOS蛋白的表達。

綜上所述，炎癥因子TNF-α和SAA可通過誘導miR-29a表達參與血管內皮損傷進程，eNOS蛋白廣泛參與該進程，而應用血管保護性藥物可一定程度上抑制miR-29a的過表達，降低eNOS蛋白的表達量，從而發揮保護血管的作用。