自噬和凋亡在口腔黏膜下纖維性變上皮組織中的表達(dá)

朱冰玉，吳穎芳

1.寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院口腔科，浙江寧波 315040；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院口腔科，湖南長(zhǎng)沙 410008

口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis，OSF）是一種發(fā)生于口腔黏膜的慢性、潛在惡性疾病[1]。OSF常表現(xiàn)為口干、進(jìn)食刺激性食物有燒灼感、進(jìn)行性張口受限等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量；其主要病理改變?yōu)樯掀そM織萎縮、固有層膠原纖維的異常堆積和固有層血管閉塞、減少[2]。盡管OSF主要是成纖維細(xì)胞疾病，但上皮位于黏膜的最表面，檳榔粗糙纖維的機(jī)械摩擦及多種化學(xué)成分首先作用于口腔黏膜的上皮組織，因此上皮的變化對(duì)OSF的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。

自噬與凋亡是細(xì)胞程序性死亡的兩種方式，對(duì)維持細(xì)胞代謝和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。自噬既可通過(guò)降解異常的胞質(zhì)和細(xì)胞器為細(xì)胞提供氨基酸和能量拮抗凋亡，也可協(xié)同凋亡促進(jìn)細(xì)胞的死亡，或作為凋亡的備份機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[3-4]。Zhao等[5]證實(shí)，自噬通過(guò)減少肺泡上皮細(xì)胞的凋亡減輕二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1可通過(guò)活性氧簇激活自噬，加重腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[6]。但在OSF病程進(jìn)展中上皮組織自噬、凋亡的發(fā)生情況及相互關(guān)系目前尚無(wú)相關(guān)研究。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)自噬標(biāo)志物蛋白LC3、P62與凋亡相關(guān)蛋白caspase-3在正常口腔黏膜與OSF早、中、晚期上皮組織中的表達(dá)水平，并分析OSF上皮組織中3種蛋白與臨床因素的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討OSF的發(fā)病機(jī)制和治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016-2019年于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院口腔科行組織病理活檢的90例OSF患者的頰黏膜標(biāo)本，根據(jù)《口腔黏膜病學(xué)》分為早、中、晚期各30例，分別為OSF早期組、OSF中期組、OSF晚期組[7]。同期收集30名無(wú)口腔黏膜疾病的健康者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡23～66歲；②無(wú)系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病，無(wú)長(zhǎng)期用藥史；③OSF患者未經(jīng)特殊治療且不伴其他口腔黏膜病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲；②有OSF治療史；③患有其他口腔黏膜疾病者。患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：201609053）。

1.2 主要試劑

LC3抗體（1∶50，美國(guó)CST公司）、caspase-3抗體（1∶50，美國(guó)CST公司）、P62抗體（1∶50，美國(guó)proteintech公司）、DAB顯色試劑盒、二步法免疫組化試劑盒。

1.3 方法

將收集的組織標(biāo)本固定于10%福爾馬林中，常規(guī)石蠟包埋切片，切片脫蠟至水，微波加熱抗原修復(fù)，3% H2O2室溫孵育10min。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，孵育一抗、二抗，PBS沖洗，DAB顯色。采用蒸餾水洗滌，蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)。不同濃度乙醇（60%～100%）脫水，中性樹(shù)膠封片、顯微鏡觀察。已知的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

采用雙盲法，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（400倍），通過(guò)染色程度（未染色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；黃色計(jì)2分；棕黃色計(jì)3分）和陽(yáng)性細(xì)胞的比例（無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分；陽(yáng)性細(xì)胞<10%計(jì)1分；陽(yáng)性細(xì)胞10%～50%計(jì)2分；陽(yáng)性細(xì)胞50%～75%計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞>75%計(jì)4分）進(jìn)行分析。最后將染色程度與陽(yáng)性細(xì)胞的比例得分相乘，結(jié)果<3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上皮細(xì)胞層厚度的比較

分析比較對(duì)照組健康者的口腔黏膜和OSF患者的上皮細(xì)胞層厚度（epithelial cell layer thickness，ET）。結(jié)果顯示與對(duì)照組健康者比較，OSF患者的ET顯著降低，且OSF晚期組患者的平均ET值最低。OSF早期組、OSF中期組、OSF晚期組患者的ET值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。所有OSF標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)上皮異常增生。

表1 對(duì)照組健康者和OSF患者的ET比較（±s）

表1 對(duì)照組健康者和OSF患者的ET比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與OSF早期組比較，＃P<0.001；與OSF中期組比較，ΔP<0.001

組別 對(duì)照組（n=30） OSF早期組（n=30） OSF中期組（n=30） OSF晚期組（n=30） 上皮細(xì)胞層厚度（層） t P27.3±2.9 24.6±3.3 3.458 <0.05*17.3±2.5 9.755 <0.001＃12.1±3.2 6.895 <0.001Δ

2.2 LC3、P62和caspase-3蛋白在各組中的表達(dá)比較

LC3和caspase-3主要在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜中表達(dá)，呈棕黃色或淺黃色；在正常口腔黏膜中主要在角化層、顆粒層和棘層上部表達(dá)，基底層幾乎不表達(dá)，而在OSF中期和晚期患者的整個(gè)上皮組織中都有表達(dá)，見(jiàn)圖1和圖2。OSF患者的上皮組織中LC3和caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著高于健康者（P<0.001）；OSF早期組、OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中LC3和caspase-3的蛋白表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P62主要在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中表達(dá)，呈棕黃色或淺黃色。在正常黏膜整個(gè)上皮組織細(xì)胞中均有染色，在OSF中、晚期主要在上皮中的基底層至棘層表達(dá)，角化層的表達(dá)較少，見(jiàn)圖3。OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中P62的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；OSF早期組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；OSF早期組、OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中P62的蛋白表達(dá)水平呈遞減趨勢(shì)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

圖1 LC3在正常口腔黏膜及OSF上皮組織中的表達(dá)（SP×400）

圖2 caspase-3在正常黏膜及OSF上皮組織中的表達(dá)（SP×400）

圖3 P62在正常黏膜及OSF上皮組織中的表達(dá)（SP×400）

表2 LC3、P62和caspase-3蛋白在各組中的表達(dá)情況比較[n（%）]

2.3 OSF上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

LC3與caspase-3的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.320，P<0.05）；P62和caspase-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.554，P<0.001）；LC3和P62的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.710，P<0.001），見(jiàn)表3。

表3 LC3、P62和caspase-3蛋白在OSF上皮組織中的相關(guān)性分析[n（%），n=90]

2.4 OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)與臨床因素的關(guān)系分析

OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、吸煙因素的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)在張口度>3cm、2～3cm及<2cm中的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 LC3、P62和caspase-3蛋白的表達(dá)與臨床因素的關(guān)系分析[n（%），n=90]

3 討論

OSF具有很高的癌變潛能，研究顯示OSF的惡性轉(zhuǎn)化率達(dá)6%[8]。近年來(lái)有研究者認(rèn)為上皮組織是OSF發(fā)生的起點(diǎn)，上皮屏障受損，細(xì)胞釋放炎癥因子，促進(jìn)黏膜下層成纖維細(xì)胞異常活化，膠原蛋白的合成和分泌增加[9]。堆積的膠原纖維和阻塞的血管，加劇上皮層缺血、缺氧的情況，造成營(yíng)養(yǎng)供給障礙，形成惡性循環(huán)[10]。本研究證實(shí)與正常口腔黏膜組織相比，OSF患者的口腔上皮組織變薄。

凋亡通過(guò)清除衰老或異常細(xì)胞在機(jī)體中發(fā)揮維持細(xì)胞功能的關(guān)鍵作用[11]。caspase蛋白酶家族在凋亡中起至關(guān)重要的作用，激活的caspase切割多種底物，引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞核DNA斷裂、細(xì)胞質(zhì)收縮和細(xì)胞膜破裂等[12]。caspase-3是caspase家族中的重要成員之一，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中一旦被激活，凋亡便進(jìn)入不可逆的階段[13]。本研究發(fā)現(xiàn)OSF患者上皮組織中caspase-3的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組健康者，且隨著OSF的加重呈遞增趨勢(shì)。Li等[14]研究表明，檳榔堿誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡與caspase-3的激活有關(guān)。因此，筆者推測(cè)在上皮細(xì)胞中，檳榔堿的細(xì)胞毒性可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。這種凋亡增加可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞數(shù)量減少，從而引起上皮組織萎縮。

自噬是細(xì)胞通過(guò)吞噬降解自身蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的自我調(diào)節(jié)過(guò)程[15]。LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺的結(jié)合是自噬過(guò)程中的一個(gè)重要步驟，該結(jié)合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ被定位在自噬體的內(nèi)外膜上，從而發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。P62作為自噬標(biāo)志物蛋白與LC3在自噬體膜上結(jié)合，然后傳遞到自噬體中，在隨后形成的自噬溶酶體中降解[17]。因此，本研究聯(lián)合檢測(cè)LC3和P62的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OSF患者的LC3表達(dá)增加且P62的表達(dá)降低，提示OSF上皮組織中自噬活性增強(qiáng)，且與OSF的病理階段顯著相關(guān)。

自噬和凋亡是細(xì)胞程序性死亡的兩種方式，二者既可相互拮抗促進(jìn)細(xì)胞存活，也可相互協(xié)同共同促進(jìn)細(xì)胞死亡。正常生理情況下，自噬一般處于基礎(chǔ)水平，將受損及衰老的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)降解再次循環(huán)利用以平衡細(xì)胞穩(wěn)定。本研究顯示OSF早、中、晚期患者出現(xiàn)自噬增強(qiáng)的情況，可能是上皮細(xì)胞受損，破壞細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，激活自噬溶酶體途徑，且隨著OSF的進(jìn)展自噬活性逐漸增加；在上皮組織中，角化層、顆粒層和棘層是LC3的主要表達(dá)區(qū)域，而P62主要在上皮中基底層至棘層表達(dá)，這可能是該層次位于上皮組織的外層，承受來(lái)自外界環(huán)境的機(jī)械摩擦和檳榔堿等化學(xué)刺激的影響，導(dǎo)致上皮角化層至棘層上部的細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3與自噬活性表達(dá)呈正相關(guān)，且隨著OSF加重，上升越明顯。筆者推測(cè)自噬和凋亡在OSF病變進(jìn)程中均發(fā)揮重要作用，并可能存在協(xié)同作用。在中期和晚期的OSF患者的口腔黏膜中，檳榔的長(zhǎng)期暴露可導(dǎo)致外層上皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，從而引發(fā)一系列細(xì)胞反應(yīng)，包括自噬活性的增加和細(xì)胞凋亡的顯著增加。

通過(guò)相關(guān)因素分析，OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、吸煙因素的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在張口度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，自噬標(biāo)志物蛋白LC3、P62與凋亡相關(guān)蛋白caspase-3異常表達(dá)在OSF的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。LC3、P62和caspase-3聯(lián)合檢測(cè)可為進(jìn)一步探討OSF上皮萎縮的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供一定的理論依據(jù)。