咪達唑侖調節cAMP/PKA/CREB通路對乳腺癌細胞的影響

蔣琦雯，徐楊，姚軍，葉棋，任帥帥

1.金華文榮醫院麻醉科，浙江金華 321001；2.上海市第六人民醫院麻醉科，上海 200233；3.金華市人民醫院麻醉科，浙江金華 321302

乳腺癌是一種惡性腫瘤，女性患者占比高達99%，發病率在女性癌癥中位居第一[1]。乳腺癌早期可采用保乳手術切除病理組織，但癌細胞增殖快、極易遷移，多發生淋巴結轉移造成全身系統疾病，必須采用放、化療結合方式提高患者的生存率，但放、化療副作用大且易復發，極大降低患者的生活質量[2]。因此，探索抑制乳腺癌細胞增殖的靶向制劑是臨床上改善患者預后的有效途徑。

咪達唑侖具有典型的苯二氮?類藥理活性，具有抗焦慮、鎮靜、催眠、抗肌肉松弛等作用，多用于治療失眠和術前誘導睡眠[3]。已有研究表明，咪達唑侖可抑制三陰性乳腺癌MDA-MD-231細胞的增殖、遷移、侵襲和間充質蛋白水平，具有作為治療乳腺癌候選藥物的潛力[4]。研究發現，環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）通路可促進腫瘤的發生、侵襲和轉移[5]。本研究旨在探討咪達唑侖對乳腺癌的影響及對cAMP/PKA/CREB通路的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 三陰性乳腺癌MDA-MD-231細胞株，購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 馬來酸咪達唑侖注射液（批準文號：國藥準字H20031037，生產單位：江蘇恩華藥業股份有限公司，規格：1ml∶5mg）；Sp-cAMPS購自美國MCE公司；胎牛血清購自美國ThermoFisher公司；青霉素鏈霉素溶液（碧云天生物科技有限公司；規格：100ml/瓶）、DMEM細胞培養基、胎牛血清、4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered solution，PBS）、RIPA裂解液、ECL超敏化學發光液、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗和結晶紫溶液購自碧云天生物科技有限公司；cAMP酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自北京正四柏生物科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT]細胞生長測定試劑盒購自美國Merck公司；Transwell小室購自北京萌壯科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技上海有限公司；一抗磷酸化（p-）PKA、PKA、p-CREB、CREB和GAPDH購自美國Abcam公司。CO2培養箱購自德國Memmert公司；細胞板、移液槍、超凈工作臺、酶標儀，購自美國Thermo Fisher公司；熒光顯微鏡購自日本Keyence公司；流式細胞儀購自美國Thermo Fisher公司；電泳儀和轉膜儀購自北京鴻濤基業科技發展有限公司；Tanon 1600全自動凝膠成像分析儀購自天能集團。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組與處理 復蘇MDA-MD-231細胞后轉入含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基中，加入100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，置于CO2培養箱（5% CO2，37℃）中無菌培養。將細胞傳代培養于96孔板中，1.0×105個/孔，隨機分為5組：對照組、咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組和咪達唑侖H+Sp-cAMPS組，每組設置6個重復孔。咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組每孔分別加入5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L咪達唑侖，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組每孔中加入20μmol/L咪達唑侖+10μmol/L Sp-cAMPS[4-6]。

1.2.2 MTT法檢測MDA-MD-231細胞的增殖能力將1.2.1項的各組細胞傳代培養于96孔板中，1.0×105個/孔，每孔加入10%體積的MTT溶液，37℃孵育4h，棄去上清，加入與初始體積等量的Formazan Solvent溶液，MTT甲臜結晶物完全溶解后，使用酶標儀檢測450nm處各孔細胞的光密度（optical density，OD），細胞增殖能力與OD值成正比。

1.2.3 細胞劃痕試驗檢測MDA-MD-231細胞的遷移能力 將1.2.1項的各組MDA-MD-231細胞接種至6孔板，1.0×106個/孔，用移液器槍頭垂直畫一條線并標記不同分區，在0h和48h拍照，計算愈合效率即細胞遷移能力。愈合效率=（0h時細胞劃痕面積－48h時細胞劃痕面積）/0h時細胞劃痕面積。

1.2.4 Transwell實驗檢測MDA-MD-231細胞的侵襲能力 將1.2.1項的各組MDA-MD-231細胞稀釋10倍，接種于Transwell小室，3×103個/室，置于37℃培養箱孵育60min。每個小室加入200μl基本培養基和700μl完全培養基，孵育過夜，再加入4% PFA和0.1%結晶紫溶液，熒光顯微鏡下拍照并計算細胞侵襲能力。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 在1.2.1項的各組細胞中加入0.25%胰蛋白酶，配制濃度為1×109個/L的細胞懸液，加入100μl細胞懸液至Falcon試管中，再加入5μl Annexin V-FTTC和5μl碘化丙啶（propidium iodide，PI），避光孵育15min，最后加入結合緩沖液靜置1h，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。統計Q2區細胞占比作為MDA-MD-231細胞凋亡率。

1.2.6 ELISA檢測細胞cAMP的表達 在1.2.1項的各組細胞中加入PBS混懸液，按ELISA試劑盒說明書配制待測標準品和樣品溶液，讀取酶標儀450nm波長處的吸光度，根據標準曲線計算樣品中的cAMP濃度。

1.2.7 蛋白免疫印跡檢測p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表達 收集1.2.1項的各組MDA-MD-231細胞，提取細胞總蛋白并定量總蛋白濃度，隨后采用蛋白免疫印跡（Western blot）法驗證蛋白的表達。配制SDS-PAGE凝膠，上樣10μg，電泳參數設為80V通電30min后轉為120V通電1h。取下凝膠，200V電壓下將已分離的條帶轉至聚偏氟乙烯（poly-vinylidene fluoride，PVDF）膜。封閉后的PVDF膜分別置于p-PKA、PKA、p-CREB、CREB（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）過夜，再經二抗（1∶500）和ECL超敏化學發光液孵育，使用Tanon 1600軟件拍照并分析蛋白表達水平。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.2統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗及單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況的比較

與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的增殖能力顯著降低（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的增殖能力顯著提高（P<0.05），見表1。

表1 各組細胞OD450值比較（±s，n=6）

表1 各組細胞OD450值比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 OD450值對照組 1.62±0.13咪達唑侖L組 1.35±0.14*咪達唑侖M組 1.09±0.12*咪達唑侖H組 0.83±0.07*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 1.40±0.13#F 38.282 P <0.001

2.2 各組細胞遷移能力的比較

與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的遷移能力顯著下降（P<0.05）；與咪達唑侖H組相比，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的遷移能力顯著提高（P<0.05），見圖1和表2。

圖1 細胞劃痕試驗檢測MDA-MD-231細胞的遷移能力

表2 各組MDA-MD-231細胞的遷移能力比較（±s，n=6）

表2 各組MDA-MD-231細胞的遷移能力比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 細胞遷移率（%）對照組 96.11±10.43咪達唑侖L組 82.26±8.18*咪達唑侖M組 73.75±7.14*咪達唑侖H組 61.54±7.79*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 90.24±12.26#F 12.789 P <0.001

2.3 各組細胞侵襲能力的比較

Transwell實驗結果表明，與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的侵襲能力顯著下降（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的侵襲能力顯著提高（P<0.05），見圖2和表3。

圖2 Transwell實驗檢測各組MDA-MD-231細胞的侵襲能力（×100）

表3 各組MDA-MD-231細胞的侵襲能力比較（±s，n=6）

表3 各組MDA-MD-231細胞的侵襲能力比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 細胞侵襲率（%）對照組 91.16±9.38咪達唑侖L組 78.25±7.23*咪達唑侖M組 74.67±8.64*咪達唑侖H組 62.74±9.53*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 88.43±8.67#F 10.248 P <0.001

2.4 各組細胞凋亡率的比較

與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞凋亡率顯著提高（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），見圖3和表4。

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

表4 各組MDA-MD-231細胞凋亡率比較（±s，n=6）

表4 各組MDA-MD-231細胞凋亡率比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 細胞凋亡率（%）對照組 2.76±0.34咪達唑侖L組 4.12±0.36*咪達唑侖M組 6.87±0.84*咪達唑侖H組 12.71±1.58*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 3.11±0.26#F 145.374 P <0.001

2.5 各組細胞cAMP表達水平的比較

咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的cAMP表達水平均顯著低于對照組（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的cAMP表達水平顯著升高（P<0.05），見表5。

表5 各組細胞cAMP表達水平的比較（±s，n=6）

表5 各組細胞cAMP表達水平的比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 濃度（pmol/ml）對照組 8.52±1.01咪達唑侖L組 6.45±0.74*咪達唑侖M組 4.81±0.54*咪達唑侖H組 2.77±0.36*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 7.51±0.88#F 56.132 P <0.001

2.6 各組細胞蛋白表達水平的比較

與對照組比較，咪達唑侖L組、咪達唑侖M組、咪達唑侖H組細胞的p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）；與咪達唑侖H組比較，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組細胞的p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），見圖4和表6。

圖4 Western blot檢測細胞中p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白的表達

表6 細胞中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平的比較（±s，n=6）

表6 細胞中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平的比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與咪達唑侖H組比較，#P<0.05

組別 p-PKA/PKA p-CREB/CREB對照組 0.84±0.11 0.98±0.08咪達唑侖L組 0.70±0.09* 0.83±0.07*咪達唑侖M組 0.58±0.07* 0.69±0.07*咪達唑侖H組 0.33±0.04* 0.37±0.03*咪達唑侖H+Sp-cAMPS組 0.79±0.10# 0.88±0.09#F 33.817 66.726 P <0.001 <0.001

3 討論

乳腺癌起源于乳腺上皮組織，臨床表現為乳房腫塊、泌乳障礙、局部擴散可侵及周圍淋巴管，全身轉移可累及臟器和骨組織，甚至導致死亡[7]。三陰性乳腺癌是乳腺癌中比較常見的一種病理亞型，具有較高的發病率[8]。目前，臨床上還沒有靶向治療乳腺癌、有效防治復發的方法，因此尋找療效好、安全性高的新型藥物，提高乳腺癌患者的生存率和生活質量勢在必行。

咪達唑侖不僅可作為鎮定劑用于外科手術，還可抑制多種腫瘤的進展。咪達唑侖能通過上調miR-217抑制肝癌細胞的轉移并促進凋亡[9]；還能抑制胰腺導管腺癌細胞增殖，抑制腫瘤相關嗜中性粒細胞、巨噬細胞和多形核骨髓來源細胞的局部浸潤，進而抑制胰腺導管腺癌進展[10]；也能抑制非小細胞肺癌細胞增殖和活力[11]。本研究發現5μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L咪達唑侖處理后的三陰性乳腺癌MDA-MD-231細胞數量減少、生長狀態變差，顯示出凋亡跡象；通過MTT法、細胞劃痕試驗和Transwel實驗檢測發現，咪達唑侖劑量依賴性降低MDA-MD-231細胞的增殖、遷移和侵襲能力，且細胞凋亡率升高，說明咪達唑侖可有效抑制MDA-MD-231細胞的活力。

cAMP廣泛存在于細胞中，多種激素、神經遞質及其他信號分子將其用作細胞內第二信使，因此，cAMP可直接調控細胞的各種生物學行為，包括細胞代謝、生長、分化、凋亡和基因表達等[12]。PKA是一種四聚體酶，可使底物磷酸化促進癌細胞侵襲和轉移[13]。CREB是PKA的底物之一，cAMP可通過調節多種靶基因的轉錄，調控PKA及其下游因子CREB，影響腫瘤的發生和發展[14-15]。本研究中，咪達唑侖處理后的MDA-MD-231細胞cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達水平下降，說明咪達唑侖可抑制cAMP/PKA/CREB信號通路。咪達唑侖對MDA-MD-231細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制可能通過抑制cAMP/PKA/CREB信號通路激活實現。為驗證咪達唑侖對MDA-MD-231細胞活力的抑制確實與抑制cAMP/PKA/CREB信號通路有關，本研究增設咪達唑侖H+Sp-cAMPS組。Sp-cAMPS是一種依賴cAMP的PKA有效激活劑[16]。相較于咪達唑侖H組，咪達唑侖H+Sp-cAMPS組MDA-MD-231細胞生長狀態好轉，增殖、遷移和侵襲能力顯著增加，細胞凋亡率降低，cAMP/PKA/CREB信號蛋白表達上調，表明經Sp-cAMPS處理增加MDA-MD-231細胞活力及cAMP/PKA/CREB信號，也印證咪達唑侖抑制MDA-MD-231細胞的增殖、遷移和侵襲與其抑制cAMP/PKA/CREB信號激活有關。

綜上所述，咪達唑侖可通過抑制cAMP/PKA/CREB信號通路的激活抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。然而，cAMP/PKA/CREB信號通路與腫瘤之間的作用復雜，需要考慮具體的腫瘤類型和背景，有研究報道，在肝癌中降低cAMP的濃度和CREB的磷酸化程度，導致癌細胞凋亡[17]。因此，關于cAMP/PKA/CREB在乳腺癌和其他類型腫瘤中的調控機制還需深入探究。