滋陰補脾方對人結腸癌裸鼠移植瘤的抑制作用機制研究

武如通 楊思華 史清華 張 蕓 黎智燊 鄭周杭

(1 廣東省第二中醫院腫瘤科,廣州,510095; 2 廣州中醫藥大學,廣州,510006)

結腸癌是常見的國內外惡性腫瘤,全球范圍內其發病率占惡性腫瘤第3位,且臨床調查顯示其在我國發病率不斷上升,嚴重影響人們生命質量[1-2]。目前,關于結直腸癌治療多以手術治療為主,但尤其癥狀較為隱匿,大部分患者確診時已屬晚期,錯失最佳根治時機,導致治療及預后不佳[3]。以化療為主的綜合治療成為結腸癌主要手段,雖可延長患者生存時間,但其不良反應明顯,且化療會導致患者免疫功能下降[4-5]。因此,尋找有效的治療結腸癌方法具有重要意義。隨著中醫藥深入研究,在惡性腫瘤治療方面的良好療效,且可減輕因化療引起的免疫功能下降和不良反應[6]。本研究探討滋陰補脾方對人結腸癌裸鼠移植瘤抑制作用及其機制,為治療結腸癌提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 4周齡BALB/c雌性裸鼠20只,體質量(18±2)g,飼養環境清潔,自由進食進水,室溫(25±2)℃,由中國科學院動物實驗中心提供,許可證號:SCHK(新)2010-0005;經廣東省第二中醫院藥理實驗中心批準(倫理審批號:048583)。細胞:人結腸癌HT29細胞(中國科學院上海生命科學研究院,貨號:AW-CCH107)。

1.1.2 藥物 氟尿嘧啶(海南桌泰制藥有限公司,批號:21071);滋陰補脾方:太子參20 g、黃芪15 g、山藥15 g、茯苓10 g、白花蛇舌草20 g,選取DHJ-D1型煎藥機煎藥30 min后取汁。

1.1.3 試劑與儀器 BCA試劑盒(上海柏絲特生物科技有限公司,貨號:23227),CD113抗體、CD116抗體、P53抗體(Abcam公司,英國,貨號:ab17、ab19、ab26)。光學顯微鏡(OLYMPUS公司,日本,型號:Olympus BX50),微量高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司,型號:TG16-W),水平式電泳儀(北京東方儀器廠,型號:GDS7600),電子天平(Satorius公司,日本,型號:BS210S)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與分組 1)模型制備:分別取對數生長期的結腸癌胰酶消化,制備細胞懸液,調整細胞濃度至5×107/mL,將0.2 mL細胞懸液接種于雌性裸鼠背部皮下。接種后的裸鼠自由飲水和進食飼養,記錄裸鼠背部移植瘤的生長情況。2)分組:選取接種結腸癌細胞株成瘤細胞在12 d左右且移植瘤平均直徑為5 mm左右的荷瘤裸鼠20只,按照隨機數字表法分隨機為對照組、化療藥物組、中成藥組和聯合用藥組,每組5只。

1.2.2 給藥方法 對照組每只裸鼠上午及下午分別注射等量生理鹽水,連續應用4 d,至第14天處死動物;化療藥物組每只裸鼠上午腹腔注射氟尿嘧啶10 mg/只,下午注射生理鹽水,1次/d,連續應用4 d,至第14天處死動物;中成藥組每只裸鼠上午腹腔注射生理鹽水,下午灌胃煮好的中藥湯劑10 mL/只(給藥相當于臨床用藥30倍,2.5 g/L劑量給藥),1次/d,連續應用4 d,至第14天處死動物;聯合用藥組:每只裸鼠腹腔注射氟尿嘧啶10 mg/只,下午灌食煎煮好的中藥10 mL/只,1次/d,連續應用4 d,至第14天處死動物收集標本。

1.2.3 檢測指標與方法 1)腫瘤重量和腫瘤體積測定:給藥期間動態觀察裸鼠背部腫瘤生長情況,隔日用游標卡尺測量移植瘤最大徑(a)及最小徑(b),實驗第14天頸椎脫位處死實驗動物,解剖出裸鼠移植瘤,電子天平沉重,測量腫瘤重量和腫瘤體積,腫瘤體積=ab2/2,抑瘤率=對照組平均體積-處理組平均體積/對照組平均體積×100%。2)蛋白印跡法測定CD113、CD116和P53蛋白表達:取瘤體組織,加入蛋白裂解液充分裂解,提取總蛋白,蛋白總量采用BCA法測定。取蛋白80 μg加入上樣緩沖液,煮沸變性5 min,將其迅速低溫冷卻后加樣,進行瓊脂糖凝膠電泳。切取含目的蛋白條帶的膠塊轉膜處理及采用含0.5%(v/v)吐溫20的Tris緩沖液(Tris Buffered Saline Containing 0.5%(v/v) Tween 20,TBST沖洗后,加入封閉液,放置于4 ℃孵育過夜;采用TBST沖洗,加入二抗,放置于室溫條件下孵育1 h;再采用TBST沖洗,凝膠成像儀曝光并顯色,測定條帶光密度值。

2 結果

2.1 各組腫瘤重量比較 與對照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯合用藥組腫瘤重量明顯降低(P<0.05);化療藥物組和聯合用藥組腫瘤重量低于中成藥組(P<0.05);聯合用藥組腫瘤重量低于化療藥物組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腫瘤重量比較

2.2 各組腫瘤體積比較 與對照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯合用藥組腫瘤體積明顯降低(P<0.05);化療藥物組和聯合用藥組腫瘤體積低于中成藥組(P<0.05);聯合用藥組腫瘤體積低于化療藥物組(P<0.05)。見表2和圖1。

圖1 各組腫瘤大小比較

表2 各組腫瘤體積比較

2.3 各組腫瘤體積抑瘤率比較 與對照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯合用藥組腫瘤體積抑瘤率明顯升高(P<0.05);化療藥物組和聯合用藥組腫瘤體積抑瘤率高于中成藥組(P<0.05);聯合用藥組腫瘤體積抑瘤率高于化療藥物組(P<0.05)。見表3。

表3 各組腫瘤體積抑瘤率比較

2.4 各組CD113、CD116和P53表達比較 與對照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯合藥物組CD113和CD116表達與前面不同下降,而P53表達升高(P<0.05);化療藥物組和聯合用藥組CD113和CD116表達低于中成藥組,而P53表達高于中成藥組(P<0.05);聯合用藥組CD113和CD116表達低于化療藥物組,而P53表達高于化療藥物組(P<0.05)。見表4和圖2。

圖2 各組CD113、CD116和P53表達

表4 各組CD113、CD116和P53表達比較

3 討論

目前,結腸癌仍以手術為主要治療方法,但其術后轉移率和復發率均較高,尤其是針對中晚期結腸癌患者,采用手術治療效果不理想,故而多依賴于化學治療[7-9]。但化學治療雖可延長結腸癌患者生存時間,但其不良反應明顯[10-13]。

中醫認為結腸癌屬“腸覃”“腸風”“腸毒”“滯下”“積聚”等范疇,隋·巢元方《諸病源候論》提出積聚病機在于“陰陽不和,臟腑虛弱,受于風邪,搏于臟腑之氣所為也”。巢元方更詳細描述:“癥者,由寒溫失節,致臟腑之氣虛弱,而食飲不消,聚結在內,染漸生長,塊段盤牢而不移動者,是癥也,言其形狀,可征驗也。”《醫宗金鑒》亦對其病因相關論述“積聚、癥瘕、腸覃之疾,皆得之于喜怒不節而傷臟,飲食過飽而傷腑,腸胃填滿,汁液外溢,為外寒所襲,與內氣血食物凝結相成也”。中醫認為結腸癌發病多因先天不足、外邪侵襲、情志內傷、飲食不節、正氣虛弱等因素,正氣虧虛,脾胃運化失司,濕毒內生,氣化無力,郁久化熱,腸腑不同,濕熱毒邪蘊結腸腑[14-16];或因恣食生冷,寒濕滯腸,均可導致濕熱蘊毒、脾失健運下迫結腸,毒聚成癰,腑氣不通而致結腸癌[17-18]。滋陰健脾方中,太子參具有益氣生津、健脾養胃、氣陰雙補功效;黃芪具有健脾益氣固表功效;山藥具有益氣養陰、補脾肺腎功效;茯苓具有利水消腫、滲濕健脾功效;白花蛇舌草具有清熱解毒、利濕通淋功效。縱觀全方可奏滋陰健脾功效。現代藥理研究表明,滋陰補脾法可增強機體免疫功能,改善物質代謝,增強造血功能,促進腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖,具有明顯抗腫瘤作用。本研究表明,與對照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯合用藥組腫瘤重量和腫瘤體積明顯降低、腫瘤體積抑瘤率明顯升高,且聯合用藥組腫瘤重量和腫瘤體積低于化療藥物組和中成藥組而腫瘤體積抑瘤率高于化療藥物組和中成藥組,由此可見滋陰補脾法可明顯降低腫瘤重量和腫瘤體積,提高抑瘤率。

P53是一種腫瘤抑制蛋白,可通過介導細胞信號轉導將應激信號傳入細胞,同時還可作為轉錄因子促進下游目的基因的轉錄,實現長期或短暫阻滯細胞周期分化、DNA復制與修復,從而達到阻止癌細胞早期增殖的目的,發揮促細胞凋亡作用[19-21]。腫瘤主要是由異質性細胞構成,而其中腫瘤細胞克隆分化與干細胞尤為相似。研究報道顯示,由于腫瘤干細胞為腫瘤起始細胞,可維持腫瘤的分化,具有異質、增殖及浸潤特性。故腫瘤干細胞被認為是腫瘤復發轉移及發生發展的根源,對其高度表達的標志物研究尤為重要。而CD類因子作為腫瘤干細胞標志物,評價CD類因子表達與惡性腫瘤相關性具有重要意義。而目前,尚無有關CD113和CD116與腫瘤方面報道,缺乏可靠參考依據。本研究表明,與對照組比較,化療藥物組、中成藥組和聯合藥物組CD113和CD116表達下降而P53表達升高,且聯合用藥組CD113和CD116表達低于化療藥物組和中成藥組,而P53表達高于化療藥物組和中成藥組,由此可見滋陰補脾法可通過下調CD113和CD116表達及上調P53表達,抑制腫瘤生長,促進腫瘤細胞凋亡。

綜上所述,滋陰補脾法可抑制人結腸癌裸鼠移植瘤生長,認為其作用機制可能與下調CD113和CD116表達及上調P53表達有關。

利益沖突聲明:無。