基于網絡藥理和分子對接探究雙氫青蒿素治療干燥綜合征的作用機制

劉瑞林,李紀高,杜明瑞,周全

(河南中醫藥大學第一附屬醫院 風濕病科,河南 鄭州 450000)

干燥綜合征(Sj?gren syndrome,SS)是一種系統性自身免疫性疾病。口干、眼干等外分泌腺損傷是SS的主要臨床表現,伴或不伴肺纖維化、腎小管酸中毒以及周圍神經病變等腺體外表現[1]。我國SS患病率為0.33%～0.77%[2],目前缺乏有效治療藥物,臨床主要以緩解口干、眼干局部癥狀為主,醫生和患者對療效的滿意度不高,藥物副作用多且花費大[3]。研究表明,中藥具有抗炎、調節免疫、抗纖維化等作用,可有效緩解患者的局部癥狀,有助于SS患者全身癥狀改善[4-5]。中醫藥也成為了研發SS治療藥物的重要領域。

SS屬于中醫“燥痹”范疇,以陰虛津虧為本[6]。青蒿自古便是治療陰虛津傷的要藥。《圣濟總錄》載有“以青蒿一斤取汁熬膏,人參末、麥冬末各一兩,丸如梧桐子”,主治煩熱口干,《溫病條辨》《時病論》等也提及青蒿治療“邪伏陰分,傷陰劫液,發熱口渴之癥”,均與SS的主癥不謀而合。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的關鍵衍生物,具有抗病毒、抗炎、調節免疫以及抗纖維化等作用[7]。目前已有DHA治療類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡等風濕病的相關研究[8-9]。本研究首次將網絡藥理學“多靶點-多通路”的分析優勢與分子對接技術相結合[10-11],分析了DHA與SS在“藥物-靶點-疾病”間的潛在分子機制,以及藥物化合物與靶點通路的相互作用,對DHA治療SS的可能機制進行了探討,以期為進一步開展中醫藥治療SS的基礎和臨床研究提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 數據庫及軟件工具

從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss平臺(http://swisstargetprediction.ch/)、PharMapper平臺(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)、GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、String數據庫(https://string-db.org/)、DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)、TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)、Venn Diagram平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中提取處理數據。使用Cytoscape 3.8.2、DAVID 6.8、Autodock 4.2.6、Auto Dock Vina 1.1.2、AutoDocktools 1.5.6、ChemBio3D Ultra 14.0、PyMoL 2.3.0以及Ligplotv 2.2.5等軟件工具分析。

1.2 研究方法

1.2.1DHA作用靶點篩選

從PubChem數據庫獲DHA的結構式,導入Swiss平臺,物種選擇“人類”。成分作用于靶點產生活性的概率>0為篩選條件,預測潛在活性成分的作用靶點。將DHA的結構導入Phar Mapper平臺,靶點篩選條件設置為“Norm Fit>0.5”[12]。

1.2.2SS疾病靶點獲取

在GeneCards、OMIM和TTD數據庫中輸入關鍵詞“Sj?gren syndrome、Sj?gren syndrome、primary Sjogren’s syndrome”進行檢索,從而得到SS疾病靶點。將所有靶點整合在excle中,剔除重復基因,經Uniprot數據庫進行校正。

1.2.3藥物-疾病核心靶點選取

將DHA作用靶點與SS靶點相互映射,作韋恩(Veen)圖,從而獲得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2軟件構建“DHA-SS靶點”網絡。

1.2.4靶蛋白相互作用網絡分析

為進一步研究藥物與疾病靶點蛋白之間的相互作用,將DHA-SS交集基因上傳至相互作用數據庫String構建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。將結果文件導入Cytoscape 3.8.2進行網絡分析[13]。挑選核心的靶點做出PPI網絡圖。

1.2.5GO功能富集和KEGG通路分析

將DHA-SS交集基因上傳至DAVID數據庫,利用DAVID 6.8 GO基因功能從生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)以及分子功能(molecular function,MF)3方面注釋DHA治療SS的作用靶蛋白在基因功能中的作用。選取GO功能條目和KEGG通路條目(P<0.05),預測DHA治療SS的主要基因功能富集過程和信號通路[14]。

1.2.6分子對接驗證

從TCMSP和PDB數據庫搜索化合物以及關鍵靶點蛋白,通過 AutoDock Vina軟件對DHA和SS關鍵靶點進行分子對接,驗證其相互作用活性,并利用PyMOL 2.3.0和Ligplot 2.5.5軟件進行相互作用模型分析。

2 結果

2.1 藥物-疾病作用靶點篩選與分析

首先篩選DHA作用靶點,通過Swiss、PharMapper平臺,分別獲得106和279個靶點,合并數據剔除重復靶點后,共得到384個靶點。然后從GeneCards、OMIM和TTD數據庫,分別獲得1 075、623和10個與SS相關的靶點,以GeneCards數據庫為準,合并數據剔除重復基因后,共得到1 685個靶點基因。將384個DHA作用靶點與1 685個SS靶點基因取交集,繪制Veen圖(圖1A),最終得到31個共同靶點(圖1B)。

A圖為DHA作用靶點與SS靶點基因Veen圖;B圖為DHA作用靶點與SS靶點基因的31個共同靶點。

2.2 DHA治療SS的PPI網絡分析

將31個交集靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件繪制PPI網絡(圖2),以靶點大小和顏色深淺反映靶點節點度值,節點度值越大,表示該靶點與DHA治療SS機制的相關性越強,以邊的粗細反映結合分數,對網絡進行拓撲分析。結果顯示,該PPI網絡中共有30個結點和166條相互關聯的邊,見表1。其中,表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、受體酪氨酸蛋白激酶-2(receptor tyrosine-protein kinase erbB-2,ERBB2)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)、半胱天冬酶-1(caspase-1,CASP1)、半胱天冬酶-8(caspase-8,CASP8)、E3泛素-蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,MDM2)是DHA治療SS的關鍵靶點,表明DHA治療SS可能是通過多個靶蛋白共同發揮作用的。

表1 核心靶點相關信息

圖2 DHA治療SS靶點的PPI網絡

2.3 GO功能富集分析

GO分析包括BP、CC、MF 3個方面,描述DHA治療SS的作用靶蛋白在基因功能中的作用。GO生物功能富集分析共篩選出137條GO條目,其中83條BP相關,30條CC相關,24條MF相關。最后以P<0.05作為標準,根據P值從小到達排列,選取前10條GO條目,繪制 GO功能富集分析圖(見圖3)。GO分析結果顯示,DHA治療SS的生物過程主要涉及細胞凋亡、增殖的正調控、信號轉導、對脂多糖的反應、對藥物的反應、蛋白質水解、細胞生長的正調控、細胞遷移的正調控、細胞表面受體信號通路、基因表達的正調控等;細胞成分主要涉及胞液、細胞質、質膜、核、核漿、細胞外區、細胞外外體、線粒體、質膜的整體部件等;分子功能相關的涉及蛋白結合、相同蛋白結合、鋅離子結合、三磷酸腺苷結合、內肽酶活性、肽酶活性、蛋白激酶活性、酶結合、雙鏈DNA結合以及氧化還原酶活性等。

圖3 DHA治療SS的GO功能富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

KEGG路通富集分析共得到68條與DHA治療SS相關的通路,根據P<0.05的數據從小到大排列,選取前15名DHA治療SS相關的通路,繪制KEGG氣泡圖(見圖4)。Y軸表示通路名稱,X軸表示富集度。氣泡越大所代表富集的基因越多,顏色越紅代表富集越顯著。結果表明,DHA可能通過調控Necroptosis通路(圖5)、Endocrine resistance通路(圖6)、IL-17通路、C-type lectin receptor 通路等治療SS。

圖4 DHA治療SS的KEGG通路富集分析

圖5 Necroptosis信號通路

圖6 Endocrine resistance信號通路

2.5 分子對接結果驗證

為進一步探索DHA與關鍵靶點之間的相互作用關系,選取CASP1、CASP8、ERBB2、EGFR和MMP9與DHA進行半柔性分子對接,結合能值越小表示分子與靶蛋白結合性越高[15](見表2)。結果表明DHA與CASP1和CASP8的結合性最高,然后依次是ERBB2、EGFR和MMP9。分子對接的結果顯示,DHA與核心靶基因之間具有良好的結合能力(見圖7)。

表2 DHA與核心靶蛋白對接結果

圖7 分子對接示意圖

3 討論

SS的發病機制復雜,上皮細胞異常凋亡和免疫炎癥反應被認為是SS外分泌腺功能受損的核心環節[16-17]。既往研究發現青蒿可以通過上調水通道蛋白5,增加SS模型鼠的唾液流量,減少小鼠飲水量[18]。部分青蒿素衍生物也被證實可以通過糾正Th1/Th2和Th17/Treg的免疫紊亂,抑制B細胞激活因子誘導的B細胞過度活化增殖,從而改善SS模型小鼠的外分泌腺的腺體損傷和炎癥浸潤,增加唾液量[19-20],這提示DHA作為青蒿素起效的主要成分在治療SS領域方面具有的巨大潛力。

本研究通過網絡藥理學分析,篩選獲得了31個靶點基因作為DHA治療SS的潛在靶點,包括EGFR、ERBB2、CASP1、CASP8和MMP9等12個核心靶點。KEGG富集分析則顯示,DHA可能主要通過細胞壞死性凋亡和內分泌抵抗兩大機制途徑改善SS。其中EGFR和ERBB2屬于表皮生長因子家族,是表皮生長因子激活的關鍵,廣泛存在于外分泌腺上皮細胞[21]。與健康人對比,SS患者的唇腺活檢顯示唾液腺和腺泡導管中EGF/EGFR表達增加[22],EGF/EGFR信號可以誘導產生大量細胞因子,促進局部炎癥。Nakamura等[23]發現,EGF在SS炎癥和細胞凋亡的信號傳導中均起著關鍵作用,不但介導了Fas通路引起的細胞凋亡,還抑制了TLR3誘導的免疫炎癥反應。多項研究也證實,DHA可以通過下調EGFR和ADAM17相關信號通路,發揮治療作用[24-25]。結合分子對接結果,EGFR與DHA之間具有較好的結合活性,提示了DHA可能通過與EGFR競爭性結合,抑制EGF/EGFR通路的激活,從而增強EGF的抗炎抗凋亡作用。

為深入了解DHA治療SS的機制,本研究還通過GO富集分析發現了137個潛在的DHA作用靶點,涉及細胞的凋亡、增殖和信號傳導等眾多可能參與SS發病的生物學過程。CASP1作為細胞自噬的關鍵靶點,影響細胞的凋亡增殖,其在SS患者的唾液中水平升高,大量活化的CASP1可以誘導促炎細胞因子IL-1β和IL-18的成熟,導致炎癥反應,提示CASP1可能是治療SS的潛在靶點[26-27]。研究發現DHA可能通過促進細胞自噬,抑制 IL-1β的產生,改善免疫環境下的炎癥反應[28]。另一個核心靶點MMP9具有降解和重塑細胞外基質的功能,其可能通過參與基底膜細胞基底層成分的降解,抑制腺體上皮細胞的修復再生,最終激活細胞凋亡,在一定程度上造成外分泌腺細胞損傷[29]。研究發現SS患者唾液腺中MMP9表達異常升高[30],提示高表達的MMP9可能通過促進IFN-γ誘導產生CXCL10參與了SS的免疫炎癥反應[31],DHA可能通過抑制MMP9的異常分泌,改善患者的炎癥反應和腺體損傷。最后藥物與疾病靶點分子對接結果也進一步驗證了DHA與相關核心靶點之間擁有較好的分子結合活性,表明DHA分子可能通過與上述EGFR、CASP1、MMP9等核心靶點的有效結合,影響上皮細胞異常凋亡和免疫炎癥反應,發揮治療SS的作用。

此外,研究還發現通過青蒿琥酯聯合二甲雙胍干預2型糖尿病大鼠,模型鼠多飲多尿、胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良等一系列糖尿病癥狀得到改善,且唾液腺損傷也明顯減輕[32],提示內分泌抵抗可能在SS發病過程中發揮了重要作用。本研究也發現內分泌抵抗通路是DHA治療SS的潛在信號通路之一。縱觀此次研究結果,除了壞死性凋亡和內分泌抵抗機制兩大主要作用機制,DHA還可能通過白介素-17信號通路、PI3K/Akt信號通路等機制影響SS的疾病進展。

4 小結

本研究利用網絡藥理學和分子對接技術,分析了青蒿素關鍵衍生物DHA可能通過多靶點多通路途徑治療SS的潛在機制。結合文獻資料,提示DHA有望成為治療SS的有效藥物。但本研究是基于公共數據庫的預測分析,可能存在部分數據的遺漏,后續研究仍需結合體內外實驗,進一步驗證DHA治療SS的具體機制。