DNAJC7高表達對肝細胞癌患者預后的影響

陳家興,楊志釗,崔永強,劉震東,張秀磊,張曉

(1.河南大學人民醫院 肝膽胰腺外科,河南 鄭州 450003;2.鄭州大學人民醫院 肝膽胰腺外科,河南 鄭州 450003;3.河南省人民醫院 a.微生物實驗室;b.肝膽胰腺外科,河南 鄭州 450003)

原發性肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一,其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占75%～85%。HCC發病隱匿,進展快,癌細胞極易復發轉移,導致HCC患者5 a生存率低[1]。傳統手術治療效果有限,而近些年出現的免疫治療、分子靶向治療等有待更多的臨床數據評估療效[2]。HCC有高度異質性的發病特征,但無高特異性和高敏感性的診療靶點,導致患者早期診斷率低及預后不佳[3-4],挖掘新穎分子生物標志物,將有助于提高診斷的敏感性及研發高特異性的靶向藥物,改善目前HCC臨床診治的瓶頸問題。

熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)可協助維持細胞結構的穩定,提高生物體對刺激的耐受,其可作為分子伴侶,參與細胞熱耐受、損傷修復等腫瘤發病的調控過程[5-6]。因此HSP既是癌癥發生和進展過程的關鍵分子,同時也可作為抗癌藥物的作用靶點[7-8]。DNAJC7是HSP家族成員之一,主要通過協助完成蛋白的折疊、裝配、運輸等過程從而發揮分子伴侶的調控功能[9]。研究顯示DNAJC7中的致病變體導致肌萎縮側索硬化癥[10-11],多聚谷氨酸化修飾的DNAJC7蛋白可以作為腎細胞癌早期診斷的一種血清生物標志物[12]。DNAJC7首次在肝臟方面的研究主要指其作為分子伴侶在小鼠肝臟Cyp2b10基因活化和脂肪變性的發展中起到了重要調控作用[13]。根據癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)中HCC的基因表達數據和相對應的臨床資料,本研究分析了DNAJC7在HCC中的表達水平、臨床預后關系以及潛在的發生發展機制,進一步驗證其用于HCC早期篩查和預后監測的可能。

1 資料與方法

1.1 數據收集

TCGA可提供基因組測序序列、表達情況、甲基化以及拷貝數變異數據等,有助于探索癌癥發病機制和挖掘關鍵的致病分子[14]。該研究在TCGA數據庫中共獲取到374例HCC患者的RNA-seq數據和臨床相關信息,其中僅有50例患者具有瘤旁組織的信息。采用兩獨立樣本Wilcoxon檢驗和配對分析法檢測這50例患者腫瘤組織與瘤旁組織中DNAJC7的表達量變化。隨后將374例HCC患者的RNA-seq數據和臨床數據進行合并,剔除臨床信息不全的患者,最終357例HCC患者的樣本信息進一步的預后相關分析和功能預測。

1.2 GO基因富集分析和KEGG基因富集分析

基因本體(gene ontology,GO)包含有大量基因參與的生物過程及所發揮的分子功能方面的信息。京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)系統地分析了基因產物的功能及在細胞中的代謝途徑,整合了代謝通路、藥物、疾病、基因序列及基因組等多方面的數據[15]。首先根據TCGA數據庫中HCC患者的數據集,取中位值為分組標準將HCC患者分為高表達組和低表達組,篩選出兩組間差異表達基因,logFC≥1且P<0.05為差異有統計學意義的基因項。本研究使用clusterPro-filer R語言包對DNAJC7進行GO和KEGG注釋分析。

1.3 統計學方法

本研究統計學數據均使用R軟件(v.3.6.1)進行分析。以DNAJC7在HCC中的中位表達水平為分組標準,將TCGA數據庫中獲得的HCC基因表達數據分為高表達組和低表達組,使用Kaplan-Meier生存曲線和Cox回歸模型對HCC患者預后相關的臨床病理特征進行分析。根據數據分析結果進一步繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線和曲線下面積(area under curve,AUC)。AUC為ROC曲線下與坐標軸圍成的面積,AUC取值范圍0.5～1.0,越接近1.0,模型效果越好,以其評估DNAJC7對HCC患者臨床潛在預后價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DNAJC7在HCC中的表達

基于TCGA數據庫中374例HCC患者腫瘤組織和50例瘤旁組織的數據分析,結果顯示DNAJC7在腫瘤組織中表達水平高于瘤旁組織(圖1A),且差異有統計學意義(P<0.001)。考慮到腫瘤組織數量多于瘤旁組織,這可能會引起統計學結果的偏差,進一步行配對分析,結果提示DNAJC7在腫瘤組織中表達水平仍高于瘤旁組織(圖1B),且差異有統計學意義(P<0.000 1)。

A圖為DNAJC7表達水平; B圖為配對后DNAJC7表達水平。

2.2 DNAJC7與HCC患者的臨床特征相關

單因素分析結果提示高表達的DNAJC7、腫瘤分期和T分期是HCC患者預后不良的危險性因素(P<0.05),見圖2A。為排除混雜因素干擾,進行多因素分析,結果提示高表達的DNAJC7和T分期是導致患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05),見圖2B。

A圖為單因素分析;B圖為多因素分析。

2.3 高表達的DNAJC7對HCC患者預后的診斷價值

Kaplan-Meier生存分析結果提示,DNAJC7低表達組HCC患者總生存期(overall survival,OS)高于DNAJC7高表達組患者(P<0.05),見圖3。ROC曲線提示,1 a AUC值為0.707,3 a AUC值為0.635,5 a AUC為0.583,說明DNAJC7對HCC患者預后具有一定的診斷價值,見圖4。

圖3 DNAJC7表達與HCC患者預后的Kaplan-Meier生存分析圖

圖4 DNAJC7在HCC患者中的預后診斷價值

2.4 DNAJC7的GO分析及KEGG分析

GO分析提示DNAJC7可能參與了細胞黏附、RNA分解代謝、鈣黏蛋白結合等過程,并可能在其中發揮了重要的作用(圖5A)。KEGG分析結果表明DNAJC7可能通過多種信號通路參與腫瘤發生和進展,如細胞內吞及氧化磷酸化等(圖5B)。即DNAJC7可能通過參與以上過程導致HCC的發生和進展。

A圖為HCC中DNAJC7相關的GO生物學信號途徑;B圖為HCC中DNAJC7相關的KEGG生物學信號途徑。

3 討論

HCC起病隱匿,病死率高,手術切除是主要治療手段[1]。患者早期無特異癥狀,大多確診時即中晚期,需挖掘新的分子生物標志物,研發靶向和免疫藥物,以提高治療效果[16]。HSP蛋白家族在腫瘤進展中起重要作用,其有多重功能,如參與未折疊蛋白反應、線粒體生物能量、凋亡、自噬、壞死、脂質代謝、血管生成、上皮-間充質轉化和腫瘤免疫等,與多種腫瘤的發病機制相關[17-18]。肝癌組織中HSPA12A、HSP90B1、HSPA4、HSPA5 和 HSPA6表達水平高于正常組織,且與早期肝癌患者的不良預后相關[19]。

DNAJ蛋白作為HSP家族成員之一,也與腫瘤進展密切相關。有研究報道DNAJA1通過miR-205-5p-EF1A1軸在HCC中高表達,與HCC患者不良預后相關[20]。DNAJC5通過調節DNAJC5-SKP2-P27通路,可以促進HCC細胞增殖,這為HCC的診斷和治療提供了新的研究方向[21]。越來越多的DNAJ蛋白在HCC中的作用被揭曉,為繼續研究DNAJ蛋白在HCC中的作用提供了理論依據[22],然而DNAJC7在HCC中尚未有研究報道。研究表明多數癌癥與TP53基因突變有關,30%～50%的HCC患者存在TP53基因突變[23]。TP53經肝炎病毒誘導后發生突變,破壞MDM2-p53軸的穩態,進而引起肝臟Kupffer細胞、肝星狀細胞和CD4+T細胞的衰竭,導致肝細胞免疫微環境紊亂,促進肝細胞轉化為肝癌細胞[24]。鑒于p53是由最重要的抑癌基因TP53編碼,p53與DNA結合具有保護DNA完整性、修復損傷DNA、抑制損傷細胞的分裂并促其凋亡的功能,因此p53可通過阻止DNA突變或受損細胞分裂來抑制腫瘤的發生與進展[25]。目前已有的研究報道證實,DNAJC7與p53在哺乳動物細胞中的調控相關,值得關注的是研究顯示DNAJC7的表達可以增強p53依賴的轉錄以及生長抑制活性,即其表達可以延長p53的半衰期[26]。當DNAJC7表達時,MDM2-p53軸功能障礙,導致p53-MDM2復合體的數量減少,提示DNAJC7使MDM2與p53解離,并參與p53-MDM2負反饋調節通路,從而提高p53的穩定性和活性。正是由于p53的抑癌特性,DNAJC7的表達可能與腫瘤抑制有關。不同的DNAJ蛋白在不同組織中的表達不同,其在腫瘤發展過程中的作用也不盡相同,既可能促進腫瘤發生,也可能是腫瘤抑制因素。

本研究主要探索DNAJC7與HCC患者臨床病理特征相關性以及對患者生存預后的影響,進而探索其可能影響HCC的分子機制。基于TCGA數據庫中HCC患者的轉錄組數據,發現DNAJC7在肝細胞癌組織中的mRNA表達量高于癌旁組織,表明DNAJC7可以作為HCC患者早期診斷的分子標志物。結合HCC患者臨床病理特征,單因素與多因素Cox回歸分析結果提示,DNAJC7的表達水平和T分期是影響患者總生存期的獨立危險因素,提示DNAJC7可以成為HCC患者預后評估的新型分子標志物。通過Kaplan-Meier曲線分析DNAJC7表達水平與HCC患者的臨床預后的相關性,結果顯示DNAJC7低表達患者的總生存期高于DNAJC7高表達患者。ROC分析結果顯示,患者1、3、5 a AUC分別為0.707、0.635、0.583,提示DNAJC7在預測HCC患者預后的方面具有一定的診斷價值。GO和KEGG分析結果表明DNAJC7可能參與了多種與腫瘤發生和進展密切相關的信號通路。以上研究結果表明,DNAJC7很可能參與了HCC細胞的生長,為后續在細胞水平上研究DNAJC7對HCC的影響提供了一定的基礎和方向。

4 結論

通過研究分析發現DNAJC7在HCC中表達上調,并且高表達的DNAJC7是患者不良預后的獨立危險因素。DNAJC7可能是HCC患者新的預后監測指標和治療靶點,可能將會作為新的分子標志物為HCC患者提供更好的篩查及預后監測指標,同時也為探究HCC發病的分子機制提供了新的研究方向。