釀酒酵母中脫氧羥腐胺賴氨酸合酶的結構研究

李珍珍,孟肖肖,喬 治,戴 莉,楊曉娜,滕衍斌

脫氧羥腐胺賴氨酸合酶(deoxyhypusine synthase, DHS)(編號:EC 1.1.1.249)普遍存在于真核生物中,參與真核翻譯起始因子-5A (eukaryotic initiation factor -5A,eIF-5A) 的翻譯后修飾,在細胞增殖、死亡、腫瘤生長、炎癥反應和免疫應答等方面發揮著重要作用[1],其缺失可導致糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病等多種人類常見疾病[2]。DHS參與eIF-5A 翻譯后修飾的首步反應,該催化依賴輔因子NAD+。DHS能夠催化脫氫亞精胺的丁胺基部分將其轉移至底物蛋白eIF-5A N端loop區保守的賴氨酸ε位氨基上,從而生成脫氧羥腐胺賴氨酸[3]。釀酒酵母作為一種重要的真核模式生物,是研究真核生物酶進化和蛋白質相互作用的經典模型,有利于研究羥腐胺賴氨酸化修飾過程[4-6]。然而DHS調控機制仍然不完全清楚,并且由于結構解析的困難,難以得到蛋白質的高分辨率結構,這限制了對DHS功能的深入理解。現以釀酒酵母中DHS(deoxyhypusine synthase, Dys1)為研究對象,通過解析其晶體結構來探究羥腐胺賴氨酸化修飾的分子機制和催化過程,為多種疾病的治療和相關藥物開發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質粒 大腸埃希菌 BL21 、大腸埃希菌 Top10菌株, pET-28a質粒(北京諾禾致源科技股份有限公司合成);S288C釀酒酵母基因組模板(中國科技大學生命科學學院提供)。

1.1.2主要試劑 重組質粒構建:高保真Taq酶(上海吐露港生物科技有限公司,貨號:21804-02);T4 DNA連接酶,限制性內切酶NdeI、NotI(美國Thermo-Fisher公司,貨號:EL0011、ER0585、ER0595);膠回收試劑盒(美國Omega公司,貨號:D2500-02);異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactoside, IPTG)(上海捷瑞生物工程有限公司,貨號:RI1758);緩沖液試劑: 三羥甲基氨基甲烷(上海生工生物工程有限公司,貨號:T0826)、氯化鈉(上海國藥集團化學試劑有限公司,貨號:10019318);晶體優化試劑:聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)8000、乙二醇、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid,Hepes)(上海阿拉丁有限公司,貨號:P274350、E117900、H109407);晶體初篩試劑盒:Crystal Screen Ⅰ、Crystal Screen Ⅱ(美國Hampton公司,貨號:HR2-110、HR2-112)。

1.1.3主要儀器 蛋白純化儀系統(型號:KTA Pure 25M,美國GE公司);SuperdexTM200層析柱(型號:HiLoadTM16/600,美國GE公司);鎳離子金屬螯合(Ni2+-NTA)親和層析柱(型號:L00250-100,南京金斯瑞生物科技有限公司)紫外分光光度儀(型號:UV-1200,上海美譜達儀器有限公司);PCR儀(型號:GE9612T-S,杭州柏恒科技有限公司);高速冷凍離心機(型號:J-26S XPI,美國Beckman公司);超聲波細胞粉碎機(型號:JY92-IIN,寧波新芝生物科技股份有限公司);體視顯微鏡(型號:EZ4W,德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1DYS1重組質粒的構建 以釀酒酵母的基因組DNA為模板進行DYS1基因的PCR擴增。PCR 反應程序如下:30個循環(94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,72 ℃ 10 min)。將擴增的DYS1基因產物經過限制性內切酶酶切、連接酶連接插入至載體pET-28a,將構建好的重組質粒進行雙酶切(NdeI、NotI)2.5 h后,將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。送至合肥有康生物有限公司測序確認其序列正確。

1.2.2Dys1目的蛋白的誘導表達及裂解液的制備 將重組質粒轉化至大腸埃希菌BL21感受態細胞中,培養重組菌株至在600 nm波長處的吸光度值為0.6,加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導劑 IPTG,在160 r/min、16 ℃條件下繼續培養20 h。離心收集表達完成的大腸埃希菌(6 000 r/min;6 min),使用20 ml 緩沖液(20 mol/L Tris pH 8.0、200 mmol/L NaCl)重懸。超聲破碎(功率30%,開1 s關5 s)15 min后離心(16 000 r/min、30 min),取上清液用于后續純化。

1.2.3親和層析法、分子篩層析法純化Dys1蛋白 將上清液上樣至Ni2+- NTA親和層析柱。上樣前使用10倍柱體積含20 mmol/L Tris pH 8.0、 200 mmol/L NaCl 的緩沖液平衡層析柱,使用5 ml含250 mmol/L咪唑、20 mmol/L Tris pH 8.0、200 mmol/L NaCl 的洗脫液洗脫目標蛋白。將洗脫液上樣至SuperdexTM200層析柱進行分子篩純化。根據280 nm吸收峰收集目標蛋白質。

1.2.4晶體生長 將純化后的蛋白質濃縮至10 mg/ml,使用試劑盒Crystal Screen Ⅰ、Crystal Screen Ⅱ初篩蛋白質晶體。生長條件為:下槽中100 μl初篩試劑,上槽中混合1 μl蛋白質和1 μl下槽液。出現晶體后進行晶體優化。

1.2.5X-射線衍射法收集晶體的衍射數據 撈取單個晶體,加入防凍液(晶體生長的條件中加20%的甘油)保存到液氮中,于上海同步輻射光源(SSRF)BL18U1蛋白質微晶體結構衍射工作線站進行X-射線衍射。在-173 ℃、0.978 ?的波長條件下收集了一套分辨率為2.8 ?的衍射數據。收集的衍射數據使用HKL2000軟件進行處理。

1.2.6分子置換法解析晶體結構 以人源(H.spains)DHS結構(PDB ID:1DHS)為模型,利用分子置換法解析結構。使用CCP4i[7]中程序MOLREP[8]找到初始相位。初始模型通過CCP4i中的REFMAC5[9]進行10輪修正,再使用COOT[10]進行人工修正。修正好的模型使用PROCHECK[11]和MOLPROBITY[12]程序進行檢查。結構圖均使用PyMol軟件(http://pymol.sourceforge.net/)生成。

2 結果

2.1DYS1重組質粒PCR測序結果 重組質粒酶切后的質粒呈現兩條DNA帶,下端的DNA帶分子量與DYS1全長序列的分子量一致(圖1A)。構建的重組質粒測定的序列與DYS1的全長基因序列相同(圖1B)。

圖1 DYS1-pET-28a重組質粒電泳圖及測序結果圖

2.2 Dys1蛋白質的純化與結晶Dys1分子量約為43 ku,通過分子篩實驗發現Dys1出峰位置對應的分子量約為130 ku,推測Dys1在溶液中以四聚體的形式存在。SDS -PAGE分析結果顯示,在分子篩純化后可見一條顯著目的條帶,Dys1蛋白質的純度達到 95% 以上(圖2A)。將純化后的Dys1蛋白質濃縮至10 mg/ml,進行晶體的初步篩選。蛋白晶體通過Crystal Screen試劑盒的初步篩選和優化實驗,最終在6% PEG 8000、8%乙二醇、0.1 mol/L Hepes pH 6.5的條件下獲得表面光滑、形狀規則的菱形蛋白質晶體。觀察發現,蛋白質晶體生長一周后達到最大體積(圖2B)。

圖2 Dys1蛋白質純化的SDS-PAGE結果與單一晶體圖

2.3 Dys1整體結構本研究通過分子置換的方法解析了Dys1的晶體結構,其分辨率為2.8 ?。最終的數據收集和結構修正參數見表1。晶體結構中,Dys1包含兩對緊密結合的二聚體(A1B1和A2B2),兩個亞基A1與B1、A2與B2形成的相互作用面積為2 830 ?2,A1與A2、B1與B2形成相互作用面積為2 470 ?2。在A1與B1、A2與B2的界面上分布有兩個對稱的活性位點(圖3A)。Dys1的單體結構包含13條α-螺旋和9條β-折疊股。α6到α7之間、α9到α10之間分別形成一段長loop區。β3、α5、β4共同形成βαβ模體。6條平行的β-折疊股(β1～2,β6～9)和4條α-螺旋(α2、α4、α13、α11)形成羅斯曼折疊,該折疊位于單體中心,結合1個NAD+分子(圖3B)。

表1 Dys1蛋白晶體結構的參數

圖3 Dys1蛋白的整體三維結構圖及單體結構圖

2.4 輔因子NAD+結合位點Dys1的催化依賴于輔因子NAD+。反應由NAD+的煙酰胺上的C4原子發起,使亞精胺的C5原子上的氫離子轉移至NAD+的煙酰胺處,從而使底物亞精胺脫氫生成脫氫亞精胺。在結構中,NAD+結合于一條深約17 ?的口袋內(圖4A)。NAD+主要通過氫鍵相互作用穩定Dys1的結構。其中腺嘌呤環與殘基Thr 329、Asp 334、Asp 363、Val 364形成氫鍵;磷酸基團與殘基Ser 108、Ser 134、Ala 338形成氫鍵;呋喃糖環與殘基Ala 135、Gly 136、Gly 304形成氫鍵(圖4B)。氫鍵相互作用有利于NAD+的結合,并穩定Dys1的構象以輔助催化反應。

圖4 活性位點口袋表面電勢圖及NAD+與周圍殘基結合位點圖

2.5 底物亞精胺結合位點底物亞精胺結合位點由His 309、Asp 262、Ser 259、Ser 108、Glu 139、Asn 109、Tyr 179、Ile 169、Glu 344、Trp 348、Ala 340、Lys 350、Leu 316,13個氨基酸殘基構成(圖5A)。其中酸性氨基酸Asp 262、Glu 139分布于結合位點入口處,可以促進堿性底物亞精胺以及eIF-5A N端loop區保守賴氨酸的進入。底物結合位點呈“L”型,在空間上該位點緊靠輔因子NAD+(圖5B),有利于發生亞精胺的脫氫反應,生成脫氫亞精胺。通過結構分析及此前催化機制推測Dys1與其他物種DHS機制類似,Lys 350的ε-氨基攻擊脫氫亞精胺C5原子與N4原子之間的碳氮雙鍵,使其斷裂,脫氫亞精胺斷裂后形成的丁胺基部分轉移至底物蛋白eIF-5A N端loop區保守的賴氨酸ε-氨基上,形成最終產物脫氧羥腐胺賴氨酸。

圖5 亞精胺口袋殘基結合位點圖及口袋表面電勢圖

2.6 Dys1的結構比對目前已有4種不同來源的DHS晶體結構,包括熱帶病錐蟲病的致病菌布氏錐蟲(Trypanosomatid.Brucei,TbDHS)極端嗜熱球古菌(PyrococcushorikoshiiOT3,PhoDHS)以及人源的DHS(Human)hDHS等。其中TbDHS為異四聚體。通過三維結構比對發現,Dys1的整體結構與PhoDHS和hDHS相似(圖6A),值得注意的是Dys1 N端缺少一段“球鏈基序”。Dys1的晶體生長在適宜的離子強度和較中性的pH 6.5條件中,該條件下N端“球鏈基序”以柔性方式展開,使活性位點暴露,方便底物進入進而完成催化。此外,Dys1在α6和α13螺旋處與PhoDHS、hDHS的結構有明顯差異。Dys1的α6和α13處螺旋長度短,在其后有一段loop環區。Dys1中NAD+分子的三維結構整體保守,只在煙酰胺環處存在差異(圖6B)。Dys1中構成亞精胺活性口袋的氨基酸在結構上高度保守(圖7),這與一級序列比對的結果一致。根據一級序列比對顯示Glu 195到Thr 221之間和Thr 375后的氨基酸殘基并不保守,使α6和α13處螺旋后的loop環區具有一定的柔性。煙酰胺環相互作用方式存在的差異可能是因為其與周圍殘基無氫鍵相互作用。一級序列比對表明構成NAD+活性口袋的氨基酸殘基(His 309、Trp 348、Lys 350、Ser 108、Gly 136、Gly 304、Asp 334、Ala 135、Thr 329、Asp 363)高度保守,其余殘基Ser 134、Ala 338、Val 364不保守(圖8)。

圖6 Dys1、hDHS和PhoDHS的整體結構與NAD+位點比對圖

圖7 Dys1、hDHS 和PhoDHS的亞精胺底物口袋位點比對圖

圖8 Dys1一級序列比較圖

3 討論

蛋白質的翻譯后修飾在多種細胞過程中發揮著重要作用,常作為一種調節機制調整環境變化時的細胞反應。其中羥腐胺賴氨酸化修飾對eIF-5A行使功能起到不可或缺的作用。DHS是催化羥腐胺賴氨酸化修飾的關鍵酶,研究[13]表明,當eIF-5A修飾位點的賴氨酸突變后,因無法進行羥腐胺賴氨酸化修飾,導致eIF-5A突變株酵母死亡,并且該修飾位點的突變也與多種人類顱面神經發育畸形等疾病相關[14]。

本研究解析了釀酒酵母中Dys1高分辨率結構,分析了Dys1的輔因子NAD+的作用位點,并將Dys1與不同來源的DHS的整體結構、NAD+結合位置以及底物亞精胺結合口袋進行對比,發現Dys1的總體結構保守,輔因子NAD+與酶的結合主要通過氫鍵相互作用穩定NAD+輔因子,底物亞精胺結合口袋高度保守。結合文獻報道[15],Dys1催化釀酒酵母eIF-5A的過程是短暫的,對eIF-5A N端結構域賴氨酸進行第一步修飾,完成后eIF-5A就會離開Dys1,并且在相互作用的過程中Dys1和eIF-5A的三維結構不會發生明顯變化。

本研究為設計有效的DHS抑制劑奠定了結構基礎,DHS的抑制劑可用于控制如HIV-1病毒復制等高增殖性疾病。未來還將繼續致力于DHS抑制劑的開發,基于Dys1的結構,通過虛擬篩選方法得到潛在的抑制劑小分子,利用體外實驗驗證小分子抑制劑與DHS親和力,設計細胞實驗和體內實驗驗證抑制效果,最終優化得到理想抑制劑,為后續相關藥物開發奠定基石。