宮頸癌組織GSTO1的表達與宮頸癌預后的相關性分析及其N-糖基化對宮頸癌惡性生物學行為的影響

于盼盼 ,楊 萍,孫倩玉,高瑋睿, 趙鄒宇,孫崇鳳

宮頸癌是惡性腫瘤之一,嚴重威脅全球婦女健康[1],每年超過30萬人死于宮頸癌[2]。目前,宮頸癌篩查、接種HPV疫苗等可明顯降低宮頸癌患者的發病率,但其轉移、復發仍是宮頸癌患者的重要死因[3]。糖基化是蛋白質翻譯后修飾中最常見的類型之一,主要包括N-糖基化和O-糖基化[4]。研究[5]顯示,蛋白質糖基化與宮頸癌的發生發展有關。谷胱甘肽S-轉移酶Omega-1(glutathione S-transferase omega-1,GSTO1)是一種谷胱甘肽轉移酶,對細胞代謝及凋亡具有調節作用[6]。臨床研究[7]顯示,GSTO1基因多態性與HPV感染易感性和宮頸癌的發生有明顯的相關性。數據庫預測GSTO1蛋白存在多個潛在的N-糖基化修飾位點。該研究旨在探索宮頸癌組織腫瘤細胞中GSTO1的表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征和預后的相關性及其 N-糖基化對宮頸癌細胞增殖、侵襲、轉移和上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床病理資料 選擇2010年11月—2019年12月石河子大學第一附屬醫院婦科診斷和手術治療的82例Ⅰ-Ⅱ期(FIGO分期,2018)宮頸癌患者作為研究對象,另收集相近時間段內33例因子宮良性疾病行全子宮切除術患者作為對照。82例宮頸癌患者中,年齡<50歲42例,年齡≥50歲40例;Ⅰ期48例,Ⅱ期34例;鱗癌65例,腺癌17例;高中分化72例,低分化10例;腫瘤直徑<2 cm 32例,腫瘤直徑≥2 cm 50例;間質浸潤深度(deep stromal invision,DSI)<1/2者42例,≥1/2者40例;有淋巴脈管間隙浸潤(lymph vascular space invasion,LVSI)21例,無LVSI 61例;有淋巴結轉移(lymph node metastasis,LNM)12例,無LNM 70例。對患者行術后隨訪,記錄患者總生存時間(overall survival, OS)。OS是指手術日至死亡日或末次隨訪日期的時間。該研究經由石河子大學第一附屬醫院倫理委員會審查并批準(批號:KJ2020-065-01),所有患者均知情同意后納入本研究。

1.1.2主要材料與儀器 宮頸癌細胞株HeLa(貨號:XF0314)購于上海復祥生物科技有限公司;GSTO1 N-糖基化定點突變慢病毒(貨號:220519DZ)購自上海吉瑪公司;GSTO1抗體(貨號:201986)以及E-鈣黏蛋白抗體(貨號:40772)、N-鈣黏蛋白抗體(貨號:76011)和波形蛋白抗體(貨號:72547)購自英國Abcam公司;DMEM培養基(貨號:C11995500BT)、胎牛血清(貨號:10099141)購自德國Gibco公司;胰蛋白消化酶(貨號:SH30042.01B)購自美國海克隆公司;細胞遷移侵襲Transwell小室(貨號:3422)、Matrigel基質膠(貨號:354234)購自美國康寧公司;EdU細胞增殖檢測試劑盒(貨號:K1075)和TBS粉末(貨號:AR0144)購自安徽白鯊生物科技公司;嘌呤霉素(貨號:107R0440)、Tween-20(貨號:85113)和二甲基亞砜(DMSO;貨號:D8370)購自北京索萊寶公司;衣霉素(貨號:B7417)購自美國伯樂公司;兔種屬來源二抗(貨號:ZB-2305)和鼠種屬來源二抗(貨號:ZB-2305)購自北京中杉金橋公司;電泳儀(型號:165-8001)和轉膜儀(型號:170-3935)購自美國伯樂公司;倒置顯微鏡(型號:IX73P2F)購自日本奧林巴斯公司;化學發光成像儀(型號:5200)購自上海Chemiscope公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 利用生物信息學數據庫GENT2(http://gent2.appex.kr/gent2/)分析GSTO1 mRNA表達情況。根據NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預測GSTO1潛在的N-糖基化修飾的氨基酸序列。

1.2.2蘇木精-伊紅染色與免疫組化 石蠟切片經過脫蠟、水化處理,蘇木精浸染5 min后分化6 s,然后藍化5 min,最后用伊紅浸洗1 min,水洗不變色后烘干封片。石蠟切片經脫蠟、水化后處理,8 min高溫高壓抗原熱修復,置于過氧化物中避光10 min,滴加GSTO1一抗(1 ∶100)4 ℃冰箱過夜,然后滴加二抗(1 ∶500)室溫孵育30 min,DBA顯色后再用蘇木精復染,最后用中性樹膠封片。GSTO1蛋白在宮頸癌組織腫瘤細胞的胞漿中著色,免疫組化染色的結果由3位年資較高的病理科醫師進行評分,根據強度分數和百分比分數的乘積計算腫瘤細胞染色強度評分分級,評分0～6分者屬于低表達或不表達,評分7～16分屬于高表達[8]。

1.2.3細胞轉染 本實驗按照慢病毒轉染說明書所示步驟進行。將宮頸癌細胞HeLa鋪入6孔板中,待細胞融合度至50%～60% 時加入含有GSTO1 55位N-糖基化突變載體基因序列(N55Q組)、135位N-糖基化突變載體基因序列(N135Q組)和190位N-糖基化突變載體基因序列(N190Q組)以及GSTO1野生型載體基因序列(WT組)和空載體基因序列(Vector組),去除原有培養基,按每孔1 ml加入不完全培養基。大概12～16 h更換為完全培養基,待細胞融合度達到80% 左右時更換含嘌呤霉素(1 μg/ml)的完全培養基連續篩選7 d,篩選成功表達GSTO1 N-糖基化55位、135位、190位定點突變以及GSTO1野生型和空載體的細胞用于后續實驗。

1.2.4EdU增殖實驗 將轉染后各組細胞均勻鋪入96孔板中(5 000個/孔),24 h后用EdU工作液孵育2 h,然后在3.7%甲醛中固定15 min。在室溫下加入含0.5% Triton? X-100的PBS通透液孵育20 min,每孔加入100 μl Click反應液,室溫暗處培養30 min,最后每孔加入100 μl的1×Hoechst33342溶液,溫室暗處培養30 min。顯微鏡下拍照,判斷細胞增殖能力。

1.2.5劃痕愈合實驗 將轉染后各組細胞均勻接種在6孔板中,待細胞融合度達到80%以上時,用移液槍的槍頭垂直于6孔板底部劃線,清洗除去脫落細胞,然后用完全培養基繼續培養。最后,在0、48 h時用倒置顯微鏡拍照,比較細胞的遷移能力。

1.2.6Transwell實驗 將200 μl 轉染后各組細胞懸液(包含2×104個細胞)加入上室,下室加入800 μl含20% 胎牛血清的DMEM培養基,恒溫孵育48 h,去除原有培養基,在4%多聚甲醛固定液中將細胞固定15 min,PBS清洗后加入結晶紫染色30 min。最后,在倒置顯微鏡下隨機選取多個不同視野拍照并計數,比較細胞的遷移能力。此外,Transwell實驗還用于測定細胞侵襲能力,在上室加入細胞懸液之前,在小室的底部先加入基質膠,其余操作均與細胞遷移實驗相同。

1.2.7Western blot實驗 將宮頸癌HeLa細胞接種于6孔板中,待細胞融合度達到80%時,分別用衣霉素(濃度0.1 μg/ml)、DMSO處理24 h后提取總蛋白質,進行Western blot實驗。衣霉素用DMSO進行稀釋,因此以DMSO組作為試劑對照組,以宮頸癌HeLa原株細胞作為空白對照。取出轉染后各組長滿細胞的6孔板,除去原有培養基,加入細胞裂解液(RIPA ∶PMSF=99 ∶1),提取細胞內總蛋白質。每組蛋白樣品取10 μl,行SDS-PAGE檢測,電泳結束后蛋白由凝膠傳遞至PVDF膜,然后與5% 脫脂奶粉一起封閉2 h,最后將PVDF膜分別放入含有GSTO1(1 ∶2 000)、EMT相關抗體E-cadherin(1 ∶3 000)、N-cadherin(1 ∶2 000)和Vimentin(1 ∶2 000)的脫脂奶粉中,在4 ℃下孵育過夜。第二天,取出PVDF膜,用TBST緩沖液浸洗30 min(平均5 min/次),隨后置于對應種屬的二抗(1 ∶20 000)中,室溫下繼續孵育2 h。最后,置于化學發光成像儀中,按照流程曝光并保存圖片,統計灰度值并比較蛋白表達的差異。本研究中所有Western blot實驗,均進行3次重復實驗并統計結果。

2 結果

2.1 GSTO1在宮頸癌組織中的表達首先,利用生物信息學數據庫GENT2檢索 GSTO1在宮頸癌組織和正常宮頸組織中表達的差異,結果顯示114例宮頸癌組織樣本中GSTO1 mRNA的表達明顯高于11例正常宮頸組織(P<0.01)(圖1A)。免疫組化結果顯示82例宮頸癌患者組織樣本中GSTO1高表達組有53例(64.6%),低表達組(陰性和低表達者)有29例(35.4%);33例對照的正常宮頸組織上皮細胞中GSTO1均呈陰性表達,二者比較差異具有統計學意義(χ2=39.562,P<0.001)(圖1B-M)。

圖1 正常宮頸組織和宮頸癌組織中GSTO1的mRNA和蛋白質表達情況

2.2 GSTO1表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系DSI≥1/2、有LVSI、有淋巴結轉移的宮頸癌患者腫瘤細胞中GSTO1高表達率高于DSI<1/2、無LVSI、無淋巴結轉移的宮頸癌患者腫瘤細胞,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 GSTO1在宮頸癌組織腫瘤細胞中的表達與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 GSTO1高表達對宮頸癌患者預后的影響隨訪納入研究的82例宮頸癌患者,隨訪截止時間是2022年10月25日,中位隨訪時間為60個月(9～144個月),其中12例(14.6%)失訪,13例(15.8%)復發,12例(14.6%)死亡。Kaplan-Meier生存曲線顯示,GSTO1高表達組的5年累計OS率(37.7%, 20/53)低于GSTO1低表達組的OS率(55.2%, 16/29),差異有統計學意義(P=0.029)。見圖2A。單因素Cox回歸分析結果顯示,FIGO分期(HR: 5.678, 95%CI: 1.583～20.366,P=0.008)、間質浸潤深度(HR: 3.806, 95%CI: 1.061～13.659,P=0.040)、淋巴結轉移(HR: 0.147, 95%CI: 0.051～0.424,P<0.001)和GSTO1表達是影響宮頸癌患者OS(HR: 7.763, 95%CI: 1.013～59.484,P=0.049)的關鍵因素。見表2。多因素Cox回歸分析顯示,FIGO分期(HR: 4.125, 95%CI: 1.112～15.308,P=0.034)、DSI(HR: 6.113, 95%CI: 1.329～28.112,P=0.020)和淋巴結轉移(HR: 4.749, 95%CI: 0.596～37.835,P=0.001)是影響宮頸癌患者OS的獨立危險因素。見表2。

圖2 宮頸癌腫瘤細胞中GSTO1不同表達的宮頸癌患者的生存曲線

表2 宮頸癌患者OS的單變量和多變量Cox回歸分析結果

2.4 宮頸癌HeLa細胞中GSTO1 N-糖基化定點突變對GSTO1表達量的影響根據NetNGlyc 1.0 Server數據庫預測GSTO1潛在的N-糖基化修飾的氨基酸序列,其中N55(P=0.67)、N135(P=0.62)、N190(P=0.69)位N-糖基化修飾的陽性率較高(圖3C)。用N-糖基化抑制劑衣霉素處理宮頸癌HeLa細胞,Western blot檢測結果發現衣霉素(0.01 μg/ml)能夠抑制癌細胞中GSTO1的蛋白表達(t=5.203,P<0.05)(圖3A-B)。構建GSTO1 N-糖基化定點突變載體(圖3D),通過慢病毒轉染獲得穩定表達GSTO1 N-糖基化定點突變的宮頸癌HeLa細胞,Western blot檢測其GSTO1的蛋白表達量,結果顯示N-糖基化定點突變組GSTO1的蛋白表達量明顯降低(tN55Q=4.272,tN135Q=4.325,tN190Q=5.713,均P<0.05)(圖3E-F)。

圖3 GSTO1 N-糖基化定點突變對GSTO1表達量的影響

2.5 GSTO1 N-糖基化定點突變對宮頸癌HeLa細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響EdU增殖實驗結果表明,與Vector組相比,N55Q、N135Q、N190Q三個突變組的細胞增殖能力下降(tN55Q=5.20,tN135Q=4.77,tN190Q=6.51,均P<0.001)(圖4A-B)。Transwell侵襲和遷移實驗結果顯示,與野生型相比,GSTO1 N-糖基化定點突變對HeLa細胞遷移(tN55Q=8.89,tN135Q=10.68,tN190Q=17.55,均P<0.001)和侵襲(tN55Q=14.80,tN135Q=5.644,tN190Q=9.810,均P<0.001)能力具有抑制作用(圖4C-E)。同時,劃痕愈合實驗結果顯示,與野生型相比,突變組細胞遷移愈合能力降低(tN55Q=8.22,tN135Q=5.36,tN190Q=11.66,均P<0.001)(圖4F-G)。

圖4 GSTO1 N-糖基化定點突變對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

2.6 GSTO1 N-糖基化定點突變對宮頸癌HeLa細胞的EMT轉化的影響HeLa細胞中轉染GSTO1 N-糖基化定點突變的慢病毒,Western blot檢測EMT標志因子E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達發現,與野生型相比,GSTO1 N-糖基化定點突變均明顯增強E-鈣黏蛋白(tN55Q=163.70,tN135Q=61.22,tN190Q=153.40,均P<0.001)的表達,同時均明顯抑制N-鈣黏蛋白(tN55Q=2.49,tN135Q=8.87,tN190Q=10.24,均P<0.05)和波形蛋白(tN55Q=2.05,tN135Q=4.32,tN190Q=4.81,均P<0.05)的表達。見圖5A-B。

圖5 GSTO1 N-糖基化定點突變后EMT標志因子的蛋白表達及灰度值統計分析柱狀圖

3 討論

在世界范圍內,宮頸癌位居女性惡性腫瘤第4位[9],盡管宮頸癌的診療策略有所改善,但是宮頸癌的病死率仍在逐年增加,腫瘤侵襲與轉移對宮頸癌的治療具有阻礙作用。

GSTO1是GST家族中Omega類的成員之一,具有獨特的半胱氨酸位點和多種還原酶活性[10]。GSTO1在結直腸癌[11]、非小細胞肺癌[12]、皮膚惡性黑色素瘤[10]等惡性腫瘤中高表達。其中研究[11]表明敲除結直腸癌腫瘤細胞的GSTO1可以提高其順鉑化療效果,可能成為結直腸癌化學治療的靶點。在非小細胞肺癌中,GSTO1可激活JAK/STAT3信號通路,促進癌細胞的增殖、侵襲、轉移并抑制其凋亡[12]。此外,GSTO1可通過EMT促進皮膚黑色素瘤腫瘤細胞的侵襲轉移[10]。本研究結果表明,與正常組織相比,GSTO1在宮頸癌組織腫瘤細胞中表達較高,其高表達與宮頸癌患者的DSI、LVSI和淋巴結轉移等臨床病理特征顯著相關,且FIGO分期、DSI、淋巴結轉移和GSTO1高表達是影響宮頸癌患者預后的關鍵因素。因此,GSTO1可能是一個潛在的靶點,可用于預測宮頸癌預后以及惡性程度,為腫瘤的診療帶來了新思路。

蛋白質糖基化在惡性腫瘤等疾病中具有重要的意義,糖基化通過多種復雜的信號通路決定腫瘤性質。腫瘤細胞的凋亡、遷移、血管生成和腫瘤細胞外基質的黏附等均與糖基化有關[13]。本研究證實GSTO1的3個N-糖化修飾位點,即Asn55、Asn135、Asn190,并且發現突變其中任意一個糖基化位點均會導致GSTO1的表達水平降低,提示N-糖基化對于維持其表達水平密切相關。最新研究[14]報道,SGK196在乳腺癌細胞中主要發生N-糖基化修飾,且SGK196 N-糖基化通過PI3K/AKT/GSK3β信號通路發揮調控功能,在乳腺癌的侵襲和轉移中發揮抑制作用。本研究通過EdU增殖實驗、劃痕愈合實驗和Transwell實驗表明,GSTO1 N-糖基化定點突變對宮頸癌細胞的增殖及侵襲遷移能力具有明顯的抑制作用。以上均提示N糖基化修飾可參與不同腫瘤的增殖和轉移。

EMT是腫瘤轉移過程中的重要機制之一。在腫瘤侵襲轉移中,EMT可以促進腫瘤細胞轉變成為具有間充質特征的細胞,從而賦予腫瘤細胞更強的侵襲和轉移能力。通過調控EMT的分子機制可以有效地抑制腫瘤細胞的侵襲轉移,從而達到治療腫瘤的效果。E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白是EMT過程中的三個關鍵分子,它們分別代表了上皮細胞和間充質細胞的特征,在調控細胞形態和功能轉變方面具有重要作用,對于EMT的發生和發展有著重要的意義[15]。本研究通過Western blot實驗發現,去除GSTO1 N-糖基化修飾,可以增加E-鈣黏蛋白的表達,抑制N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達,表明GSTO1 N-糖基化定點突變可抑制宮頸癌細胞的EMT轉化。

本研究揭示了GSTO1在宮頸癌組織腫瘤細胞中高表達及其與患者的不良預后相關。此外,GSTO1 N-糖基化參與宮頸癌的增殖和轉移并且可能影響癌細胞中EMT的轉化,這對于探討宮頸癌侵襲轉移發生的機制,尋求宮頸癌防治新策略,具有重要指導意義。但目前本研究尚未明確GSTO1 N-糖基化在宮頸癌侵襲轉移過程中作用的特定分子機制,因此,未來需要進一步探究。