甲基-β-環糊精通過限制脂質代謝抑制橫紋肌肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲

胡亞飛,闞 晨,汪思應

橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是兒童中最常見的軟組織肉瘤。RMS總發病率約為4.5/100萬[1]。近年來,隨著手術、化療技術的提高以及新型抗癌藥物的出現,RMS的治療水平顯著提升,但仍有復發和預后不良的情況出現[2-3]。有研究表明[4],脂質代謝重編程參與多種腫瘤發生發展的進程,但其在肉瘤中的作用尚不清楚。從脂質代謝重編程的角度來探究肉瘤發生發展的機理為肉瘤治療提供新的方向。課題組前期結果表明與正常肌肉組織相比,肉瘤組織中脂質合成相關基因高表達。基于此,該研究采用脂質抑制劑甲基-β-環糊精(methyl-β-cyclodextrin, mβCD)對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞進行處理,探究其分子機制。該研究結果可能為人骨骼橫紋肌肉瘤治療提供一個新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株與實驗動物 人骨骼橫紋肌肉瘤細胞系(RD、SJCRH30和A673)購自上海細胞庫,短串聯重復序列鑒定正確。人骨骼肌細胞系(HSMC)購自湖南豐輝生物科技有限公司。實驗動物選用8只 4～5 周齡的 BALB/C雌性裸鼠,體質量 16～20 g(購自江蘇集萃藥康生物科技股份公司),動物實驗經安徽醫科大學動物倫理委員會批準(批準號:LLSC 20210807)。飼養條件:SPF 級環境中飼養,環境溫度20～24 ℃,濕度40%～70%,通風換氣15～20次/h,設置12 h 光照12 h 黑暗交替。

1.1.2主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS,貨號: S711-001S)購自美國Lonsera公司,DMEM高糖培養基(貨號:PM150210)、RPMI-1640培養基(貨號:PM150110)購自武漢普諾賽生命科技有限公司,細胞計數盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)檢測試劑盒(貨號:GK10001)購自美國GLPBIO公司,基質膠(Matrige,貨號:356234)、細胞培養小室(Transwell小室,貨號:353097)購自美國BD公司,結晶紫染色液(貨號:G1063)購自北京索萊寶科技有限公司,TRIzol總RNA提取試劑(貨號:CW0580)購自江蘇康為世紀生物科技有限股份公司, EVO M-MLV反轉錄預混型示蹤試劑盒(貨號:AG11734)、SYBR GreenProTagHS 預混型qPCR 試劑盒(貨號:AG11476)購自湖南艾科瑞生物工程有限公司,qRT-PCR引物購自上海生物工程有限公司,mβCD(貨號:GC32697)購自美國GLPBIO公司,三酰甘油(triglyceride,TG)檢測試劑盒(貨號:E1013-50)購自北京普利萊公司,細胞培養箱(型號:Galaxy170S)購自德國Eppendorf公司,酶標儀(型號: Varioskan LUX)購自美國賽默飛生物有限公司,實時熒光定量PCR儀(型號:CFX96)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1GEPIA數據庫分析 利用GEPIA數據庫分析脂質合成相關基因在正常肌肉組織和肉瘤組織中的表達情況。發現脂質合成相關基因在肉瘤組織中高表達,故后續通過qRT-PCR驗證。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞SREBP1和SQLEmRNA表達 采用TRIzol法提取細胞(HSMC,RD,SJCRH30和A673)總RNA,測定其RNA濃度和純度后,使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。利用SYBR Green Pro Tag HS 預混型進行 qRT-PCR 檢測,反應體系為 20 ul,每組樣品設置 3個復孔。擴增程序為:95 ℃預變性30 s ,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s。共41個循環。目標基因SREBP1引物 F: 5′-CGGAACCATCTTGGCAACAGT-3′,R: 5′-CGCTTCTCAATGGCGTTGT-3′ ;SQLE引物F:5′-GATGATGCAGCTATTTTCGAGGC-3′,R: 5′-CCTGAGCAAGGATATTCACGACA-3′。

1.2.3實驗分組與處理 本研究分為3組對照組和實驗組,對照組1:正常培養的人骨骼橫紋肌肉瘤細胞系RD;實驗組1: mβCD(1mmol/L)處理的RD;對照組2:正常培養的人骨骼橫紋肌肉瘤細胞系SJCRH30;實驗組2: mβCD(1 mmol/L)處理的SJCRH30;對照組3:正常培養的人骨骼橫紋肌肉瘤細胞系A673;實驗組3: mβCD(1 mmol/L)處理的A673。用于后續平板克隆、軟瓊脂集落形成、細胞遷移侵襲和TG檢測實驗。

1.2.4細胞培養 HSMC、RD、A673細胞培養于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的 DMEM高糖培養液中,SJCRH30細胞培養于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素RPMI-1640培養液中。所有細胞均在 37 ℃、5% CO2加濕培養箱中培養,當細胞培養至對數生長期,采用0.25%胰蛋白酶消化方式對細胞進行傳代。后續試驗細胞均為8～15代。

1.2.5細胞增殖實驗 CCK-8試劑盒用于檢測細胞的增殖能力。將細胞(RD、SJCRH30、A673)接種于96 孔細胞培養板中,每孔細胞密度為2 000個,培養液為體積100 μl。4 h后使用新鮮培養液將mβCD稀釋為5個梯度(0、0.5、1、1.5、2 mmol/L)。棄去 96 孔板內原有培養液,加入含上述濃度的mβCD培養液。培養0 、24 、48 、72 h后,加入10 μl CCK-8溶液, 孵育2 h。其中,0 h檢測時間在細胞貼壁后(即培養4～6 h)。用多功能酶標測量儀檢測 450 nm處的吸光度值。

1.2.6平板克隆實驗 細胞消化離心后,按每孔1 500 個細胞量接種到6孔板內,每組3個復孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2的加濕細胞培養箱內培養10 d左右。時間到后,在孔內加入0.1 % 結晶紫染色液對細胞染色固定,拍照留存。

1.2.7軟瓊脂集落形成實驗 按照1 ∶1的比例將培養液和1.2%的瓊脂糖溶液混合均勻鋪在6孔板待凝,此過程約30 min。隨后將0.7%瓊脂糖溶液與含各組細胞(每孔2 000個細胞)的完全培養基混合液加入6孔板中待凝,此過程30 min。之后在每孔內加入適量培養液,防止蒸發。14 d后鏡下觀察。

1.2.8細胞遷移實驗 細胞消化計數,并用無血清培養液重懸,稀釋為每孔3×104。在24孔板孔內加入600 μl完全培養液,之后將小室放入孔內,吸取各組無血清細胞懸液加入到小室上層。將24孔板放在37 ℃、5% CO2的加濕細胞培養箱內培養48 h。之后對小室清洗,結晶紫染色,對小室下層細胞進行統計。

1.2.9細胞侵襲實驗 按照1 ∶6的比例將基質膠與無血清培養液混合,每個小室200 μl混合液,待凝。此過程大約1 h。細胞消化計數,并用無血清培養液重懸,稀釋為每孔3×104。在24孔板孔內加入600 μl完全培養液,之后將小室放入孔內,吸取無血清細胞懸液加入到小室基質膠上層。將24孔板放在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養48 h。之后對小室清洗,結晶紫染色。對小室下層細胞進行統計。

1.2.10裸鼠成瘤 將細胞數為5×106,體積為150 μl的SJCRH30細胞懸液分別接種到小鼠腋下。3 d后,對照組小鼠開始隔天腹腔注射150 μl無菌PBS,實驗組小鼠隔天腹腔注射150 μl用PBS溶解后的mβCD溶液,藥物劑量為400 mg/kg。期間記錄小鼠體質量,測量腫瘤體積。

1.2.11脂質組學 將對照組(SJCRH30)和實驗組(1 mmol/L mβCD處理)細胞消化離心,按照每組細胞數為1×107裝到無菌1.5 ml EP管內,每組取3個樣本。將樣本在4 ℃離心機離心5 min,轉速為 2 000 r/min。棄上清液,收集細胞沉淀于 1.5 ml 離心管中。標記好EP管,將EP管的尖底插入液氮中,淬滅細胞沉淀 1 min,-80 ℃冰箱內保存。收集好樣本后由歐易生物公司完成后續檢測。

1.2.12TG檢測 將細胞消化離心計數,細胞數為1×106。后續按照說明書操作,多功能酶標測量儀在波長550 nm處讀取數據,分析結果。

2 結果

2.1 脂質合成相關基因在人骨骼肌細胞和人骨骼橫紋肌肉瘤細胞中的表達情況腫瘤基因表達數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析結果發現,與正常肌肉組織相比,脂質合成相關基因在肉瘤組織中高表達。見圖1A。選取數據庫中表達差異最明顯的兩個基因SREBP1和SQLE在人骨骼肌細胞和人骨骼橫紋肌肉瘤細胞中驗證。qRT-PCR結果顯示:與HSMC相比,人骨骼橫紋肌肉瘤細胞(RD、SJCRH30和A673)SREBP1基因和SQLE基因mRNA表達均升高(SREBP1:tRD=26.62,tSJCRH30=93.50,tA673=12.15, 均P<0.001;SQLE:tRD=26.09,tSJCRH30=21.21,tA673=12.09,均P<0.001)。見圖1B-C。

圖1 數據庫結果及SREBP1、SQLE基因在不同細胞的相對表達情況

2.2 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞增殖能力的影響CCK-8實驗結果顯示,與對照組(0 mmol/L)相比,0.5、1、1.5、2 mmol/L mβCD處理的RD、SJCRH30和A673細胞的增殖能力均下降(0.5 mmol/L:tRD=8.69,tSJCRH30=6.08,tA673=23.05;1 mmol/L:tRD=15.29,tSJCRH30=25.76,tA673=22.98;1.5 mmol/L:tRD=16.86,tSJCRH30=46.04,tA673=31.76;2 mmol/L:tRD=58.67,tSJCRH30=53.46,tA673=35.69,均P<0.01)。見圖2。

圖2 不同濃度mβCD處理后各組細胞的增殖能力

2.3 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞形成克隆能力的影響平板克隆結果顯示,與對照組相比,mβCD處理的RD、SJCRH30、A673細胞形成的克隆數目明顯減少。(tRD=9.92,tSJCRH30=15.48,tA673=10.36,均P<0.001)。見圖3。

圖3 mβCD處理后各組的細胞克隆情況

2.4 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞遷移、侵襲能力的影響細胞遷移實驗結果顯示,與對照組相比,mβCD處理的RD、SJCRH30和A673細胞遷移數目下降(tRD=12.81,tSJCRH30=15.62,tA673=10.09,均P<0.001)。見圖4。此外,與對照組相比,mβCD處理的RD、SJCRH30、A673細胞侵襲數目也明顯下降(tRD=7.05,tSJCRH30=4.74,tA673=8.76,均P<0.01)。見圖5。

圖4 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞遷移能力的影響

圖5 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞侵襲能力的影響

2.5 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞軟瓊脂集落形成能力的影響腫瘤細胞具有非錨定生長能力。軟瓊脂集落形成實驗結果顯示,與對照組相比, mβCD處理的RD、SJCRH30、A673細胞軟瓊脂集落形成數量減少(tRD=4.00,tSJCRH30=5.00,tA673=4.03,均P<0.05 )。見圖6。

圖6 mβCD處理后各組細胞的軟瓊脂集落形成能力

2.6 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞成瘤能力的影響裸鼠成瘤實驗結果表明,與對照組相比,mβCD組小鼠重量減輕,但無統計學意義。見圖7C。與對照組相比,mβCD組腫瘤體積明顯下降(接種后15 d:t=2.76,P<0.05;接種后17 d:t=3.19,P<0.05;接種后19 d:t=4.81,P<0.01;接種后21 d:t=4.93,P<0.001)。見圖7A、B、D。同時mβCD組腫瘤重量也降低(t=6.62,P<0.001)。見圖7E。以上這些結果均可證實mβCD具有抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細胞的成瘤能力。

圖7 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞成瘤能力的影響

2.7 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞中脂質代謝物的影響主成分分析圖、偏最小二乘-判別分析和正交偏最小二乘方-判別分析三種統計分析結果顯示,對照組和實驗組有差異。見圖8A-C。表明人骨骼橫紋肌肉瘤細胞在mβCD處理后,脂質代謝物發生變化。此外,在變量權重值(variable important in projection,VIP)>1,t<0.05的篩選條件下,篩選出128個差異代謝物。見圖8D。紅色原點為實驗組中顯著上調的代謝產物(P<0.05, VIP>1 且fold chage (FC)>1),共75個。藍色原點為實驗組中顯著下調的代謝產物(P<0.05, VIP>1 且FC<1),共53個。灰色原點代表無顯著變化的代謝產物。KEGG富集通路分析結果顯示,mβCD可抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細胞中TG的代謝物生成(tTG(16:1/18:1/18:1)=5.85,tTG(16:1/16:1/18:1)=14.71,tTG(16:0/18:1/18:1)=6.41,tTG(16:0/16:1/18:1)=4.00,tTG(16:0/18:1/20:4)=9.78,tTG(18:0/18:1/18:1)=3.02,均P<0.05)。見圖9。TG檢測試劑盒檢測結果顯示:與三組人骨骼橫紋肌肉瘤細胞相比,mβCD(1 mmol/L)處理組TG含量均降低(tRD=7.78,tSJCRH30=9.34,tA673=2.20,P<0.01)。見圖10。提示mβCD很可能通過降低TG含量來減輕人骨骼橫紋肌肉瘤細胞的惡性程度。

圖8 多元統計分析及火山圖

圖9 KEGG富集通路分析圖

圖10 mβCD對人骨骼橫紋肌肉瘤細胞TG含量的影響

3 討論

RMS 是軟組織惡性腫瘤的一種,具有高度的侵襲性,主要影響兒童。然而,其治療和預后的效果并不十分理想[5],探究新的治療靶點尤為重要。該研究通過探究橫紋肌肉瘤細胞中脂質合成相關基因的表達情況,發現其脂質合成較正常細胞上升,mβCD可能通過抑制脂質合成而減輕橫紋肌肉瘤惡性程度,為RMS治療提供新的視角。

腫瘤的發生受多重因素影響,如環境改變和基因突變等[6-7]。近年來發現脂質代謝重編程成為癌癥的主要特征之一[8],已被眾多研究者關注,但在肉瘤方面的研究仍有很大欠缺。本研究從脂質合成的角度入手,探究脂質代謝重編程在肉瘤的發生發展中的作用。通過查閱數據庫發現,相較正常肌肉組織,脂質合成相關基因在肉瘤組織中高表達,并在qRT-PCR中得到驗證,結果與數據庫相一致。提示在肉瘤中脂質代謝可能也進行重編程。有文獻報道mβCD是一種有效的脂質小分子藥物抑制劑,它可以將細胞質膜的疏水結構封裝在其內部疏水腔中,并連續地從外層質膜中提取膽固醇等相關脂質[9]。持續的膽固醇消耗增加細胞膜張力及其可變性,使細胞容易發生獨立于細胞骨架狀態的破裂[10]。利用此特性,它可以通過抑制PI3K-Akt-Bad通路的激活,誘導癌細胞凋亡[11]。然而mβCD對于橫紋肌肉瘤的影響目前仍然未知。本研究表明mβCD可以抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細胞的克隆形成、遷移以及侵襲。裸鼠成瘤實驗進一步驗證mβCD可以抑制人骨骼橫紋肌肉瘤的生長。以上結果都表明mβCD可以抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細胞的惡性程度。本研究脂質組學結果分析顯示mβCD處理后可降低人骨骼橫紋肌肉瘤細胞中TG含量。TG增高也是腫瘤發展的誘因,也有研究[12]將其作為治療靶點。同時用TG檢測試劑盒對脂質組學的結果進行驗證,結果表明mβCD處理后人橫紋肌肉瘤細胞TG含量降低。在本研究中雖證明mβCD可以抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為,且可能是通過降低TG含量發揮的抑制作用,為橫紋肌肉瘤的治療提供了一個新的思路。但本研究仍有不足之處,關于mβCD抑制人骨骼橫紋肌肉瘤細胞惡性的分子機制還有待進一步探究,TG合成與人骨骼橫紋肌肉瘤細胞惡性程度的相關性需要進一步厘清,調控人骨骼橫紋肌肉瘤細胞TG合成的基因需深度挖掘。