阿司匹林誘發(fā)GSDME依賴性細胞焦亡對結(jié)腸癌細胞增殖的影響

司馬學(xué)琴,蘇延停,李成武

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一,國外的一項流行病學(xué)研究[1]結(jié)果顯示,其發(fā)病率為所有惡性腫瘤的前三位,且近年來發(fā)病率與病死率呈上升趨勢,但目前對于結(jié)腸癌的發(fā)病機制仍不清楚。近期研究[2]顯示其發(fā)生機制可能與結(jié)腸腫瘤組織中腫瘤干細胞的無限增殖和異常分化能力有關(guān)。由于腫瘤分子生物學(xué)近些年的快速發(fā)展,分子靶向治療成為臨床腫瘤治療研究的熱點,已經(jīng)有越來越多的靶向治療藥物應(yīng)用于臨床[3]。阿司匹林對結(jié)腸腫瘤的預(yù)防作用已被逐漸證實,但其具體作用機制尚未闡明[4]。細胞焦亡是一種依賴于白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)轉(zhuǎn)化半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate and specific proteinase 1,Caspase-1)、多種炎癥因子為誘因的細胞死亡形式[5],研究[6]表明辛伐他汀通過觸發(fā)焦孔素E(Gasdermin E,GSDME)介導(dǎo)的細胞焦亡引起胃癌細胞死亡,但目前尚無關(guān)于阿司匹林能否通過誘發(fā)GSDME依賴性細胞焦亡從而影響結(jié)腸癌細胞增殖的研究。因此本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)分析阿司匹林對結(jié)腸癌細胞增殖的影響及這一過程與GSDME依賴性細胞焦亡的相關(guān)性,為結(jié)腸癌的分子靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑阿司匹林(貨號:A2093)購自美國sigma公司,人結(jié)腸癌Caco-2細胞購自上海中科院細胞庫;MTT分析試劑盒(貨號:ab211091)購自Abcam(上海)貿(mào)易有限公司;乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放檢測試劑盒(貨號:C0016)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-1β、白介素-18(interleukin-18,IL-18)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(貨號:EK101BHS、EK118)購自北京中杉金橋公司;一抗NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)(貨號:bs-41293R)、Caspase-1(貨號:bs-20616R)及山羊抗兔IgG二抗(貨號:bs-40295G)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;一抗GSDME-N(貨號:ab215191)購自Abcam(上海)貿(mào)易有限公司;內(nèi)參β-actin抗體(貨號:bb-2101)購自上海貝博生物科技有限公司;GSDME siRNA購自北京華泰億康生物科技有限公司;胎牛血清(貨號:12483020)及DMEM培養(yǎng)基(貨號:11965092)購自美國Gibco公司,蛋白免疫印跡試驗(Western blot)相關(guān)試劑和胰蛋白酶-EDTA混合液(貨號:C0201)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;LipofectaminTM2000(貨號:11668030)轉(zhuǎn)染試劑購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 主要儀器恒溫培養(yǎng)箱(型號:HHCP-160S)購自沃爾福(上海)實業(yè)有限公司;倒置顯微鏡(型號:CKX41)購自日本OLYMPUS公司;高速離心機購自上海醫(yī)用分析儀器廠(型號:TGI-16);實時熒光定量PCR儀(型號:CFX Connect)、電泳儀(型號:1658033)與轉(zhuǎn)膜儀(型號:Trans-Blot Turbo)購自美國伯樂公司;全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(型號:GeneGenius)購自美國SYGENE公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 在培養(yǎng)皿中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細胞,置于CO2含量為5%的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),飽和濕度。傳代條件:培養(yǎng)2～3 d,細胞密度>80%。用胰蛋白酶-EDTA混合液消化傳代后培養(yǎng)。細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗。

1.3.2MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期的細胞,以每孔約5×103個細胞的密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板上進行培養(yǎng),待細胞貼壁后,倒去原培養(yǎng)基,分別加含有不同濃度的阿司匹林(1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mmol/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),同時加入等量原培養(yǎng)基作為空白對照組,每組設(shè)3個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出細胞培養(yǎng)板,每孔中避光加入20 μl的MTT粉劑溶液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后取出,用PBS溶液輕輕洗滌,加入20 μl的DMSO溶液,使用酶標儀在570 nm波長下測量吸光度值,生長抑制率=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。根據(jù)實驗結(jié)果,選擇細胞生長抑制率達平臺期的濃度用作后續(xù)實驗。

1.3.3轉(zhuǎn)染 當15 mmol/L阿司匹林處理好的Caco-2細胞培養(yǎng)密度達到50%后進行siRNA沉默GSDME(siRNA-GSDME)操作,按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h后進行實驗。

1.3.4顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 取處于對數(shù)生長期的細胞,接種到6孔板中,并立即放在培養(yǎng)箱中,待細胞貼壁后,用15 mmol/L阿司匹林處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,后期沉默GSDME基因,在顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)。

1.3.5LDH釋放實驗 收集15 mmol/L阿司匹林處理好的細胞和對照組細胞,1 000 r/min離心5 min,吸取各孔中的上清液,按步驟依照試劑盒說明書測定LDH釋放量。

1.3.6Western blot檢測蛋白表達水平 收集15 mmol/L阿司匹林處理好的細胞和對照組細胞,加入RIPA 裂解液,置于冰上裂解30 min,在高速離心機4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min,吸取上清液提取總蛋白,用BCA法測定各組細胞蛋白濃度,各組加入緩沖液后放入100 ℃沸水中水煮變性后備用。按每孔30 μg蛋白上樣,凝膠電泳并濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,分別加入NLRP3(1 ∶1 000)、Caspase-1(1 ∶1 000)、GSDME-N(1 ∶1 000)及β-actin(1 ∶500)抗體,4 ℃孵育10 h,加入山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h后,用TBST溶液洗膜3次,涂上發(fā)光顯影液用顯影儀拍照,用ImageJ軟件分析相應(yīng)灰度值。

1.3.7ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β和IL-18的含量 將收集到的處理后的Caco-2細胞懸液以1 000 r/min離心5 min后,收集15 mmol/L阿司匹林細胞和對照組細胞上清液,依照ELISA試劑盒說明書按步驟測定IL-1β和IL-18的含量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度阿司匹林對Caco-2細胞增殖活性的影響給予不同濃度的阿司匹林分別處理Caco-2細胞48 h,采用MTT法檢測增殖抑制率,結(jié)果顯示:48 h不同濃度組細胞增殖抑制率分別為(5.80±0.68)、(11.22±0.93)、(21.14±1.26)、(35.52±1.54)、(50.34±0.69)、(50.66±1.83)。與1.0 mmol/L組相比,2.5 mmol/L組細胞增殖抑制率增加(t=7.627,P<0.05);與2.5 mmol/L組相比,5.0 mmol/L組細胞增殖抑制率增加(t=7.310,P<0.05);與5.0 mmol/L組相比,10.0 mmol/L組細胞增殖抑制率增加(t=9.975,P<0.01);與10.0 mmol/L組相比,15.0 mmol/L組細胞增殖抑制率增加(t=10.215,P<0.01),提示阿司匹林表現(xiàn)出一定劑量依賴性抑制Caco-2細胞的增殖。當濃度超過15.0 mmol/L后其濃度效應(yīng)達到平臺期,與15.0 mmol/L組相比,20.0 mmol/L組對細胞增殖抑制無差異(t=1.061,P>0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度阿司匹林對Caco-2細胞增殖抑制作用的比較

2.2 阿司匹林對Caco-2細胞焦亡的影響用濃度為15 mmol/L的阿司匹林的培養(yǎng)基培育Caco-2細胞48 h,在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化,并應(yīng)用LDH 釋放檢測試劑盒檢測細胞上清液中LDH含量。結(jié)果如圖2A所示,與對照組相比,阿司匹林組細胞數(shù)目減少,并且能夠明顯觀察到細胞膜出現(xiàn)腫脹甚至破裂現(xiàn)象和細胞膜內(nèi)容物流出等典型的細胞焦亡形態(tài)學(xué)特征。如圖2B所示, 應(yīng)用阿司匹林后細胞上清中LDH 的含量增加(t=6.738,P<0.05)。

圖2 阿司匹林對Caco-2細胞形態(tài)和細胞上清中LDH含量的影響

2.3 阿司匹林對Caco-2細胞中焦亡相關(guān)因子表達的影響Western blot結(jié)果顯示如圖3所示,與對照組相比,阿司匹林組能明顯提升Caco-2細胞中焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、GSDME-N蛋白表達水平(tNLRP3=6.479,tCaspase-1=6.293,tGSDME-N=5.704,均P<0.05)。

圖3 阿司匹林對Caco-2細胞焦亡相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較:*P<0.05

圖4 阿司匹林對Caco-2細胞上清中IL-1β、IL-18含量的影響與對照組比較:**P<0.01

2.4 阿司匹林對Caco-2細胞上清中IL-1β與IL-18的影響ELISA結(jié)果如圖5所示,與對照組相比,阿司匹林能夠明顯提升Caco-2細胞中焦亡相關(guān)因子IL-1β與IL-18的水平(tIL-1β=11.357,tIL-18=12.953,均P<0.01)。

圖5 沉默GSDME對Caco-2細胞焦亡的影響

2.5 沉默GSDME對Caco-2細胞焦亡的影響使用siRNA-GSDME沉默Caco-2細胞(阿司匹林處理濃度為15 mmol/L)中的GSDME,Western blot結(jié)果顯示, GSDME的關(guān)鍵剪切片段GSDME-N處于低表達狀態(tài),提示GSDME沉默成功(圖5A);沉默組較15 mmol/L阿司匹林組細胞增加,細胞膜較為完整,細胞破裂少見,細胞上清中LDH 的含量明顯降低(t=6.258,P<0.05)。見圖5B、C。

2.6 沉默GSDME后對Caco-2細胞上清中IL-1β與IL-18的影響ELISA結(jié)果顯示,與阿司匹林組相比,沉默GSDME明顯抑制焦亡相關(guān)因子IL-1β與IL-18的水平(tIL-1β=9.953、tIL-18=11.026,均P<0.01)。見圖6。

圖6 沉默GSDME對IL-1β、IL-18含量的影響與阿司匹林組比較:**P<0.01

3 討論

結(jié)腸癌作為我國常見的惡性腫瘤,嚴重影響患者的健康,早期診斷與治療是改善結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。近些年來,由于傳統(tǒng)治療方式的局限性以及人們對惡性腫瘤分子生物學(xué)研究的深入,分子靶向治療已成為新的研究方向。阿司匹林是一種臨床常用的非甾體抗炎藥,除了抗風濕及預(yù)防心腦血管疾病意外,研究[7]表明,長期低劑量使用阿司匹林能夠降低結(jié)腸癌的發(fā)病率,因此被臨床推薦應(yīng)用于抗結(jié)腸癌的預(yù)防治療中。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實阿司匹林具有抗炎與抗腫瘤免疫作用,但機制尚未完全明確,可能與炎癥反應(yīng)可以刺激腫瘤細胞的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。本研究通過給予含有不同濃度阿司匹林的培養(yǎng)基培養(yǎng)干預(yù)結(jié)腸癌Caco-2細胞,結(jié)果顯示阿司匹林對于Caco-2細胞增殖活性的抑制具有時間與濃度依賴性,說明阿司匹林能夠抑制其增殖,但機制尚未明確。

細胞程序性死亡包括細胞凋亡、壞死及焦亡等[9]。與凋亡及壞死不同,細胞焦亡是由半胱氨酸天冬酶Caspase家族介導(dǎo)的細胞程序性死亡,當細胞受到外源刺激時,細胞內(nèi)形成NLRP3炎癥小體,從而活化Caspase-1,切割Gasdermin家族的GSDMD與GSDME[10]。當GSDME被切割后會產(chǎn)生GSDME-N片段,研究[11]表明GSDME-N具有在細胞膜上成孔的特性,導(dǎo)致細胞焦亡發(fā)生。當細胞焦亡發(fā)生時,細胞膜腫脹破裂、細胞核皺縮、包含炎性因子的細胞內(nèi)容物向胞外釋放。Caspase-1的結(jié)構(gòu)中包括3個結(jié)構(gòu)域,其中一個結(jié)構(gòu)域可與炎性體中的銜接蛋白發(fā)生相互作用,進而將炎性細胞因子 pro-IL-1β和 pro-IL-18切割裂解成響應(yīng)免疫細胞中的炎性刺激的活性形式IL-1β和IL-18。當細胞焦亡發(fā)生時,細胞內(nèi)容物中含有大量炎癥因子IL-1β和IL-18,并會隨著細胞膜破裂而流出[12]。本研究結(jié)果顯示,使用含有阿司匹林的培養(yǎng)基干預(yù),能明顯增加Caco-2細胞中NLRP3、Caspase-1、GSDME等基因的蛋白表達,提高Caco-2細胞上清液中IL-1β及IL-18的含量,說明這一過程中有細胞焦亡發(fā)生。此外本研究結(jié)果顯示,在使用含有阿司匹林的培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細胞后細胞上清中LDH水平明顯上升,提示細胞膜完整性發(fā)生了破壞,進一步說明了細胞焦亡可能參與了阿司匹林對Caco-2細胞的作用過程。

有研究報道稱,GSDME在胃癌[13]和乳腺癌[14]中的表達被沉默,表明GSDME可能在癌癥進展中發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果顯示,在正常Caco-2細胞中GSDME的關(guān)鍵剪切片段GSDME-N蛋白處于低表達狀態(tài),而給予使用含有阿司匹林的培養(yǎng)基培養(yǎng)干預(yù)后GSDME的蛋白表達量明顯上升,同時給予阿司匹林干預(yù)后Caco-2細胞數(shù)目明顯減少,并且能夠明顯觀察到細胞膜出現(xiàn)腫脹甚至破裂,細胞膜內(nèi)容物流出等典型的細胞焦亡形態(tài)學(xué)特征。當通過siRNA沉默GSDME后細胞上清液中LDH釋放減少,說明細胞膜破裂程度減輕,且細胞形態(tài)少見細胞焦亡形態(tài)學(xué)特征,進一步說明了GSDME是焦亡發(fā)生過程中的關(guān)鍵,而阿司匹林或許能通過誘發(fā)GSDME依賴性細胞焦亡發(fā)揮抗腫瘤細胞增殖的作用。