牙齦卟啉單胞菌感染及維生素D通路蛋白表達對食管鱗癌患者生存預后的影響

錢夢凡,孔金玉,劉怡文,孫 蔚,周福有,高社干

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)發病機制尚未明確,病死率極高[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)感染已被證實為ESCC患者預后不良的主要高危因素[2]。資料顯示,維生素D(vitamin D,VitD)是人體必需的脂溶性維生素,不僅可促進生長和骨骼鈣化,還可降低病原微生物載量,誘導腫瘤細胞凋亡,發揮抑癌作用[3-4]。其中,VitD 24-羥化酶(vitamin D 24-hydroxylase,CYP24A1)、VitD 1α-羥化酶(vitamin D 1α-hydroxylase,CYP27B1)及VitD受體(vitamin D receptor,VDR)為VitD代謝通路中的關鍵調控因子,三者活性的改變參與腫瘤發生發展[5],且CYP24A1和VDR的基因多態性與ESCC顯著相關[6]。基于VitD代謝受阻與ESCC的發病密切相關[6]及病原微生物可通過干擾VitD代謝促進腫瘤惡性發展[7],推測Pg感染及VitD代謝通路關鍵調控因子表達改變可能與ESCC患者預后密切相關。

該研究旨在通過檢測ESCC患者組織中Pg感染情況及CYP24A1、CYP27B1與VDR表達情況,分析各指標對患者生存預后的影響,以期為ESCC患者臨床防治策略的制定提供可靠指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑與儀器 Pg抗體(意大利Diatheva公司,貨號:ANT0085),CYP24A1(武漢Proteintech公司,貨號:25174-1-AP)、CYP27B1及VDR抗體(英國Abcam公司,貨號:ab206655、ab3508);二步法免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號:PV-9000);檸檬酸鈉抗原修復液、DAB顯色試劑盒及PBS(北京Solarbio公司,貨號:C1032、DA1010、P1010);蘇木精(南京建成生物工程研究所,貨號:I030-1-1);中性樹膠(上海Sangon Biotech公司,貨號:E675007-0100)。組織切片掃描儀(匈牙利3DHIESTECH公司,型號:Pannoramic MIDI),光學顯微鏡(日本 Nikon公司,型號:ECLIPSE Ni-E)。

1.1.2病例資料 選擇安陽市腫瘤醫院2015年1月—2017年1月行ESCC根治術的185例ESCC患者為研究對象。收集手術切除的ESCC組織石蠟包埋樣本進行常規切片,切片厚度為3 μm,用于后續指標檢測。本研究于術前獲得患者知情同意,并且通過安陽市腫瘤醫院倫理委員會審核批準(倫理批號:2023WZ16K01)。入組標準及排除標準見圖1,最終納入173例ESCC患者。患者隨訪期為60個月,生存時間為確診時間至死亡或確診后60個月。

圖1 本研究ESCC患者入組標準

1.2 方法IHC染色根據IHC試劑盒及DAB顯色試劑盒說明書步驟進行IHC染色。采用Pg、CYP24A1、CYP27B1與VDR抗體按說明書推薦濃度進行抗體孵育。結果判讀:① 染色強度評分:無著色、淺黃色、棕黃色及棕褐色分別為0、1、2、3分;② 陽性細胞百分比評分:≤5%、>5%且≤25%、>25%且≤50%、>50%且≤75%及>75%分別為0、1、2、3、4分。①與②乘積為最終IHC評分。于400倍光學顯微鏡下判讀各指標染色結果,隨機拍攝5個視野并計算IHC評分的平均值。本研究中,各指標判定標準為:<2分為陰性,≥2分為陽性[2,8-9]。

1.3 統計學處理運用SPSS 22.0軟件進行統計分析。采用χ2檢驗分析Pg感染情況及CYP24A1、CYP27B1與VDR表達情況之間相關性以及各指標與患者臨床病理特征之間相關性。用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線并用Log-rank檢驗生存曲線之間的差異。單因素Cox回歸計算風險比例(hazard ratios,HR)及其95%置信區間。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCC組織中Pg、CYP24A1、CYP27B1與VDR的表達情況采用IHC檢測173例ESCC組織中Pg感染情況及CYP24A1、CYP27B1與VDR表達情況。結果如圖2所示,ESCC細胞胞漿出現棕黃色顆粒代表上述各指標陽性,Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR的陽性率分別為43.35%、37.57%、20.23%及21.97%。Pg感染與CYP24A1、CYP27B1及VDR相關(均P<0.05)。見表1。

表1 ESCC組織中各指標之間的關系[n(%)]

圖2 ESCC組織中Pg、CYP24A1、CYP27B1

2.2 Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR與ESCC患者臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗分析各指標與ESCC患者臨床病理特征之間的關系。結果如表2所示,在男性、有吸煙史、有飲酒史、腫瘤分化程度為低分化、浸潤深度侵及纖維膜、有淋巴結轉移及TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期的患者中,Pg感染率及CYP24A1陽性率更高(均P<0.01)。在腫瘤浸潤深度未侵及纖維膜、無淋巴結轉移及TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期的患者中,CYP27B1及VDR陽性率更高(均P<0.01)。

表2 Pg、CYP24A1、CYP27B1及VDR與ESCC患者臨床病理特征之間的關系[n(%)]

2.3 Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR對ESCC患者生存預后的影響生存分析結果顯示,Pg及CYP24A1陽性組患者生存率低于陰性組患者(均P<0.05),CYP27B1及VDR陰性組患者生存率低于陽性組患者(均P<0.05)。將IHC結果里4張連續切片同時滿足Pg感染與CYP24A1表達陽性、CYP27B1與VDR表達陰性的患者歸為Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高風險組(共62例),不滿足上述條件的歸為低風險組(共111例)。結果顯示:高風險組患者生存率低于低風險組患者(均P<0.05)。此外,Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高風險組患者預后最差,死亡風險最高(HR=4.59, 95%CI: 3.04～6.71)。見圖3、表3。

圖3 各組ESCC患者術后5年生存曲線

2.4 Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高低風險組對不同ESCC人群生存預后的影響以患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史及TNM分期為分層變量,分析不同ESCC人群中Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高低風險組患者生存時間之間差異,結果如圖4、表4所示,在各分層標準的ESCC人群中,高風險組患者死亡風險均較高,預后均較差(均P<0.05);尤其是在TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期的ESCC人群中,與低風險組相比,高風險組患者的死亡風險增加更為明顯(HR=19.83, 95%CI: 5.70～68.98,P<0.05)。

表4 各臨床病理特征高風險組與低風險組ESCC患者的生存曲線比較

圖4 各組ESCC患者術后5年生存曲線

3 討論

VitD為免疫調節劑,在機體的抗感染免疫中發揮重要作用。VitD不僅可以促進巨噬細胞和單核細胞產生防御素和抗菌肽,增強其抗菌活性,還可與免疫細胞上的VDR結合,刺激免疫細胞增殖分化,調節固有免疫和適應性免疫,參與清除病原微生物、減輕組織損傷[10]。VitD能降低乙肝病毒及幽門螺桿菌等病原微生物載量,抑制肝癌及胃癌的惡性演進[3-4],還能抑制病原微生物毒力因子(如黏附素、蛋白酶等)活性,削弱其致病力[11]。乙肝病毒可通過下調VDR表達,阻止活性VitD發揮作用,降低機體免疫防御功能,協助自身大量復制,促進肝癌細胞的惡性增殖[7]。

VitD代謝通路中關鍵調控因子表達量改變可促進多種腫瘤惡性演進[12]。CYP24A1是活性VitD的滅活酶,可滅活1,25-二羥基維生素D3,抑制其發揮功能,在多種腫瘤中的表達量顯著高于癌旁正常組織,已被證實為潛在的促癌基因[8,12-14]。CYP27B1是VitD合成的關鍵限速酶,其表達與肺、前列腺、結腸以及甲狀旁腺腫瘤的進展呈負相關,且在多種惡性腫瘤中均可發揮抗癌作用[14]。VDR是VitD發揮功能的主要受體,VitD代謝通路主要依靠二者結合作用于靶細胞發揮效應。在消化系統腫瘤中,VDR表達量降低與發病風險增高有關[12]。Yang et al[6]發現血漿中的VitD水平與ESCC顯著相關,且VDR和CYP24A1的基因多態性與ESCC易感性相關。Bao et al[15]發現VDR高表達的ESCC患者生存期顯著高于VDR低表達患者,且體外細胞模型發現VDR是ESCC的抑制因子,上調VDR基因表達可抑制ESCC細胞增殖。上述研究與本研究結果一致。但目前ESCC研究中,尚無Pg感染及VitD通路基因之間相關性的報道。本研究發現,ESCC組織中Pg、CYP24A1、CYP27B1及VDR的陽性率分別為43.35%、37.57%、20.23%及21.97%。其中,Pg感染與CYP24A1、CYP27B1及VDR相關,表明Pg感染的ESCC細胞中CYP24A1活性增強,而CYP27B1及VDR活性降低。Pg感染陽性和CYP24A1表達陽性組的患者中,男性、有吸煙史及飲酒史的患者比例增加,提示可能由于大多數男性患者長期吸煙、飲酒,口腔環境差,造成Pg及CYP24A1陽性率均增高。兩個指標陽性組患者中,腫瘤分化程度為低分化的患者比例增加,提示惡性程度更高的ESCC微環境更適合Pg定植,定植部位CYP24A1多為高表達。Pg+24A1+27B1-VDR-高風險組,腫瘤浸潤深度侵及纖維膜、有淋巴結轉移及TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期的患者比例增加。表明Pg感染、VitD代謝通路中CYP24A1陽性率增高及CYP27B1與VDR陽性率降低可加速ESCC惡性進程。

本研究生存分析結果顯示,Pg感染與CYP24A1表達陽性組、CYP27B1與VDR表達陰性組患者生存期均縮短,表明Pg感染及VitD代謝通路相關蛋白表達改變與ESCC患者預后不良密切相關;Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高風險組患者,死亡風險更高,表明同時滿足上述指標改變的患者生存預后更差。此外,本研究發現在各分層標準的ESCC人群中,高風險組患者死亡風險均較高,預后均較差,表明Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-可作為ESCC患者預后預測的可靠指標。