SP1在食管鱗癌組織中的表達及其對食管鱗狀細胞增殖和凋亡的影響

黃紅芳,盧香云,孫夢菲,崔曉賓,2

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一[1],生存預后較差,僅不到20%的患者生存時間超過5年[2]。雖然食管癌治療方法多樣,但外科手術仍是食管癌治療最有效的方式[3],然而術后預后效果不佳,存在嚴重的術后不良反應[4]。研究[5]發現,特異性蛋白(specific protein, SP)是一個重要的轉錄因子家族,其包括SP1、SP2和SP3。SP1是第一個在哺乳動物中被鑒定和克隆的SP家族蛋白,SP1作為靶基因表達的調節劑可與功能蛋白特別是轉錄因子相互作用參與調控多種生物過程。SP1還參與癌基因、抑癌基因的表達,影響細胞生長、凋亡、分化等多種細胞基本功能,在多種腫瘤中高表達,并且與患者的不良預后有關[6]。然而,SP1在食管鱗癌發生發展中的作用尚不明確,有待進一步研究。該研究旨在探討轉錄因子SP1在食管鱗癌中的表達及其對食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)細胞生物學功能的影響,分析其與ESCC患者生存預后的關系,從而為ESCC患者的臨床預后提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 該研究收集了喀什第一人民醫院、烏魯木齊市自治區人民醫院、石河子大學醫學院第一附屬醫院3所醫院2015年—2016年間的食管鱗癌石蠟包埋組織標本121例。由石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科兩位專家審查確診為食管鱗狀細胞癌,依照第8版食管癌分期標準對組織樣本進行TNM分期,所有患者均已簽署知情同意書(倫理學批號:shzu2015CG09),通過電話等聯系方式隨訪至2022年5月。

1.1.2細胞系、試劑與儀器 食管鱗癌細胞系(Eca109貨號:iCell-h056、EC9706貨號:YS105C)購自中國科學院北京細胞庫;無血清1640培養基(貨號:IMC-202)購自廈門逸漠生物科技有限公司;兔抗人SP1單克隆抗體購自英國艾博抗貿易有限公司(貨號:ab231778);EDTA修復液(貨號:abs9247)購自北京愛必信生物科技有限公司;SP siRNA(小干擾RNA)購自上海吉瑪公司sense sequence:CCAGCA-ACAUGGGAAUUAUdTdT anti-sense sequence:AUA-AUUCCCAUGUUGCUGGdTdT;BSA封閉液(貨號:SW3015)購自北京索萊寶科技有限公司;LiP 2000轉染試劑(貨號:18324012)購自上海invitrogen生命技術公司;CCK-8試劑盒(貨號:C0042)、凋亡試劑盒(貨號:70-AP101-100)分別購自日本同仁和聯科生物。高壓鍋(型號:7970A)購自上海儀濤生物儀器有限公司;CO2細胞培養箱(型號:I-5110-230V)、差速離心機(型號:Sorvall ST40)均購自美國賽默飛世爾科技公司;光學顯微鏡(型號:CX23 雙目)購自日本Olympus公司;轉膜儀(型號:DYC-Mini4)、電泳儀(型號:1658033)均購自美國伯樂生命醫學產品有限公司;流式細胞儀(型號:FACSCanto Ⅱ)購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化法染色及結果判定 利用免疫組織化學實驗法對收集的組織蠟塊進行切片、烘干后依次進行脫蠟、脫二甲苯、脫酒精,隨后將切片放進盛滿EDTA修復液的塑料盒內置于高壓鍋行高溫高壓修復,并在室溫條件下進行冷卻降溫,BSA封閉液37 ℃下封閉反應30 min,去除廢液后4 ℃孵育一抗(1 ∶1 200)過夜,第二天在37 ℃恒溫箱中復溫完成后用PBS沖洗滴加二抗(1 ∶1 000)恒溫箱孵育2 h,再次沖洗后進行顯色、復染和酸酒精的分化,最后樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察結果,取相應組織做陽性對照,用PBS溶液代替一抗做陰性對照。SP1主要定位于細胞核,核染棕黃色為陽性。根據陽性細胞所占百分比計分:<5%計0分,6%～25%記1分,26%～50%記2分,51%～75%記3分,76%～100%記4分。根據陽性細胞著色強度計分:無著色計0分,黃色計1分,棕黃色計2分,棕色計3分。兩個判定標準相乘≤8分為低表達,>8分為高表達。結果由兩名以上經驗豐富的病理學醫師評定,意見不一致時由上級醫師做最終評定計分并錄入統計學軟件。

1.2.2細胞轉染 細胞計數完成后,將Eca109和EC9706細胞分為si-Control組和si-SP1組(Western blot實驗設置3組轉染濃度:100、120、140 nmol/ml)并均勻接種于6孔中,待細胞密度達70%～80%時進行轉染,將轉染試劑(5 μl liP 2000)、SP1 siRNA(14 μl、sense sequence:CCAGCAACAUGGGAAUUAUdTdT anti-sense sequence:AUAAUUCCCAUGUUGCUGGdTdT)分別加入125 μl的無血清1640培養基中混勻,活化20 min后移至孔板內。

1.2.3Western blot實驗 將轉染好的細胞進行蛋白的提取:將配好的裂解液(PMSF:RIPA裂解液=1:100)覆蓋孔板,于4 ℃冰箱孵育30 min,用細胞刮板將孔板內的細胞刮下,移至EP管中,置于差速離心機(12 000 r/min)內離心15 min后取出,計算體積并煮沸,按照制膠-電泳-上樣-轉膜-封閉-孵育一抗(1 ∶1 000)8 h-孵育二抗(1 ∶10 000)2 h-洗膜步驟依次操作,最后于避光室內滴加化學發光試劑進行顯色。

1.2.4克隆實驗 通過CCK-8細胞增殖實驗檢測兩組食管鱗癌細胞系的集落形成能力,將轉染后的細胞(400～500個)均勻接種到12孔培養板中培養10～14 d,間隔3 d進行換液,觀察細胞生長情況。待克隆集落形成后,移除廢液,PBS清洗,孔板內加入多聚甲醛固定30～40 min,染色完成后拍照,利用ImageJ軟件進行計數。

1.2.5CCK-8細胞增殖實驗 通過CCK-8細胞增殖實驗檢測兩組食管鱗癌細胞系的增殖能力。將轉染好的si-Control組,si-SP1組和空白對照組(僅培養基)消化離心接種至96孔板內,并于每個時間點(0、24、48、72、96 h)鋪一個96孔板,每組設置5個復孔,分別于0、1、2、4、5 d后于避光條件下在各孔內依次加入10 ul CCK-8試劑,作用2 h后,上機(避光)檢測450 nm波長處吸光度值。

1.2.6流式細胞術 利用流式細胞術檢測兩組食管鱗癌細胞系的凋亡能力,于12孔板內進行轉染(計數后每孔細胞數約1×104);待轉染48 h后,把5 μl的 PI及10 μl的 FITC加于處理好的細胞中(空白組不加),避光5 min,在每個流式管中加入2 ml PBS及處理好的細胞,上機檢測,記錄結果。

1.3 統計學處理應用SPSS 25.0統計軟件處理數據;計數資料采用絕對數(%)表示,計數資料組間比較采用χ2檢驗;正態分布計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗,不服從正態分布計量資料組間比較采用非參數檢驗;繪制SP1表達與食管鱗癌關系的Kaplan-Meier生存曲線圖, log-rank檢驗用作生存曲線的比較;Cox回歸分析評定相關指標能否作為獨立預后因子。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SP1在食管鱗癌及癌旁正常組織中的表達情況免疫組化結果顯示食管鱗癌癌旁正常組織(圖1A、B)、食管鱗癌組織中SP1均定位于細胞核(圖1C、D)。食管鱗癌組織和癌旁正常組織中SP1蛋白表達陽性率分別為26.4%和1.4%。癌組織中SP1的蛋白表達陽性率高于癌旁正常組織(χ2=20.568,P<0.001)。

表1 SP1在食管鱗癌與癌旁正常組織中的表達

圖1 食管鱗癌癌旁正常組織與食管鱗癌組織中SP1蛋白的表達情況

2.2 食管鱗癌組織中SP1蛋白表達與臨床病理特征之間的關系食管鱗癌組織中,SP1蛋白在女性、中低分化、浸潤深度T3～T4級的高表達率高于食管鱗癌癌旁正常組織(均P<0.05),差異具有統計學意義。見表2。

表2 食管鱗癌患者不同臨床病理特征中SP1蛋白表達的比較

2.3 SP1蛋白表達與食管鱗癌患者生存預后的關系通過生存曲線結果圖可以發現,食管鱗癌患者中SP1蛋白高表達的患者生存時間低于SP1低表達的患者(P=0.048)。見圖2。單因素Cox回歸分析顯示,淋巴結轉移(P=0.004)和TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)(均P<0.01)是影響食管鱗癌患者生存時間的危險因素,多因素Cox回歸顯示TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)是影響患者生存期的獨立危險因素(P<0.001)。見表3。

表3 食管鱗癌患者生存預后獨立危險因素單、多因素Cox回歸分析

圖2 SP1蛋白的表達情況與食管鱗癌患者預后關系的生存曲線圖

2.4 沉默SP1后食管鱗癌細胞的SP1蛋白表達情況為摸索SP1 siRNA的最佳的作用濃度,我們選取食管鱗癌Eca109細胞系進行Western blot實驗,以檢測不同SP1 siRNA濃度(100、120、140 nmol/ml)作用下SP1的表達水平。結果顯示,與對照組相比,轉染濃度在140 nmol/ml、作用48 h的Western blot 條帶最淺,沉默效果最佳(圖3)。

圖3 不同SP1 siRNA濃度轉染Eca109細胞系后SP1蛋白的表達

2.5 沉默SP1對食管鱗癌細胞增殖的影響CCK-8細胞增殖實驗結果顯示,沉默SP1后,食管鱗癌Eca109細胞系培養至48 h時,si-SP1組與si-Control組的細胞增殖能力開始出現明顯差異(t=5.377,P<0.001);而對于食管鱗癌EC9706細胞系,在沉默SP1后培養至24 h時,增殖能力就已出現明顯差異(t=2.340,P=0.047);隨著培養時間的延長,待細胞培養至96 h時,食管鱗癌Eca109細胞系(t=8.722,P<0.001)和EC9706細胞系(t=8.635,P<0.001)中si-SP1組的細胞增長能力均低于si-Control組(圖4)。平板克隆實驗結果同樣提示,食管鱗癌Eca109細胞系中,si-SP1組的集落形成能力明顯低于si-Control組(t=6.332,P<0.001),在食管鱗癌EC9706細胞系中,si-SP1組的集落形成能力低于si-Control組(t=7.690,P<0.001,圖5)。以上實驗結果表明沉默SP1可以抑制食管鱗癌細胞的增殖。

圖4 沉默SP1后食管鱗癌細胞(Eca109、EC9706)的增殖能力

圖5 沉默SP1后食管鱗癌細胞(Eca109、EC9706)的集落形成能力

2.6 沉默SP1對食管鱗癌細胞凋亡的影響在食管鱗癌Eca109細胞系中,si-SP1組凋亡指數(16.38±4.01)高于si-Control組凋亡指數(6.72±2.68),差異具有統計學意義(t=3.69,P<0.05);在食管鱗癌EC9706細胞系中,si-SP1組凋亡指數(11.77±3.31)高于si-Control組凋亡指數(5.80±2.18),差異具有統計學意義(t=4.91,P<0.001)。提示沉默SP1蛋白可以促進食管鱗癌細胞的凋亡。見圖6。

圖6 沉默SP1后食管鱗癌細胞(Eca109、EC9706)的凋亡能力

3 討論

食管鱗狀細胞癌在腫瘤中具有較高的發生率,生存預后較差,缺乏有效的治療方案[7]。食管癌的發生發展機制較為復雜,與多種影響因素相關[8],探索食管鱗癌發生發展的機制以尋求食管鱗癌新型治療手段已成為當前研究的目標。截止目前,SP1蛋白在食管鱗癌組織中的表達及其對食管鱗癌細胞增殖、凋亡的生物學行為影響的研究較少。在本研究中,免疫組化發現SP1在食管鱗癌組織中的表達高于癌旁正常組織,且主要表達在食管鱗癌組織的細胞核內。SP1蛋白在女性、低中分化及浸潤深度T3～T4級的食管鱗癌組織中表達率更高,Cox單因素回歸分析提示有遠處轉移、淋巴結轉移和TNM分期是影響食管鱗癌患者生存時間的危險因素,TNM分期是影響患者生存期的獨立危險因素。

SP家族轉錄因子在多種細胞過程中起著至關重要的作用,SP1、SP3和SP4調控多種癌癥相關的基因,這些基因參與細胞周期、細胞增殖、細胞分化和凋亡[9]。有研究[10]表明,轉錄增強因子1可以通過激活SP1促進結直腸癌細胞增殖。此外,SP1還可以與RasGRP1啟動子結合,促進其轉錄,進而誘導肝細胞的增殖[11]。另有研究[12]證明,甘草查爾酮A通過下調SP1的表達誘導口腔鱗癌細胞的凋亡。本研究利用SP1 siRNA轉染食管鱗癌Eca109和EC9706細胞系,通過CCK-8細胞增殖試驗、克隆實驗發現si-SP1組的細胞增殖能力及集落形成能力明顯低于si-Control組,si-SP1組的細胞凋亡指數明顯高于si-Control組。本研究在Eca109和EC9706兩株食管鱗癌細胞系中驗證了SP1蛋白對食管鱗癌細胞增殖及凋亡,補充了SP1蛋白在食管鱗癌發生發展過程中關系的相關研究。有研究[13]表明在食管鱗癌中長鏈非編碼RNA FGD5-AS1作為microRNA-383上的競爭內源性RNA,可通過增加SP1的表達來增強食管鱗狀細胞癌的惡性特征,這與本研究的結果一致。這些研究提示,SP1具有促進食管鱗癌發生發展的作用。

綜上所述,本研究表明SP1在食管鱗癌組織中高表達,并且沉默SP1能夠抑制食管鱗癌細胞的增殖和凋亡,SP1可能成為食管鱗癌潛在的分子治療靶點。但是SP1在食管鱗癌組織中高表達的分子機制尚未明確,未來將通過細胞學實驗和動物實驗進一步探究SP1在食管鱗狀細胞癌中表達的發生機制,更深層次探索SP1在食管鱗癌進展中的作用。