RAB10對胰腺癌細胞生物學功能的影響及臨床意義

匡 鵬,張欽泉,程 盛,董 毅,王理承,張思璐,葉家欣,馬丹丹,李中虎 ,張智勇,

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤,5年生存率約為10%[1],據美國腫瘤研究機構[2]估計,截止2022年,約49 830例患者死于胰腺癌,在所有惡性腫瘤中占比8.2%。作為預后極差的消化道惡性腫瘤,胰腺癌臨床診治困難,手術干預效果不佳[3]。近些年來一些新型的治療方法,如免疫抑制、分子靶向、聯合放化療均效果不佳[4-5],早期手術切除仍是目前唯一有效的治療方法[1]。因此,尋找與胰腺癌有關的基因,基因檢測手段的使用對胰腺癌的早期診斷、改善其生存和預后顯得尤為重要。RAB10基因位于人染色體 2p23.3[6],國內外研究[7-10]表明RAB10在膠質瘤、骨肉瘤、宮頸癌、肝癌等多種惡性腫瘤的發展中表現出癌基因特征。RAB10在胰腺癌組織中的表達水平可能影響胰腺癌細胞的生物學功能。該研究旨在探討RAB10在胰腺癌組織中的表達情況,并研究沉默、過表達RAB10對胰腺癌細胞生物學功能的影響以及RAB10的表達水平對胰腺癌患者臨床相關預后的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器RAB10、GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Abcam公司(貨號:ab237703、ab245357、ab263962)。L15購自上海iCell公司(貨號:iCell-0009)。FBS購自美國Gibco公司(貨號:10091-148)。EdU細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司(貨號:C0071S)。凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司(貨號:CA1020)。Transwell小室購自美國Corning公司(貨號:3422)。Matrigel膠購自美國BD公司(貨號:356234)。BCA 蛋白定量試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司(貨號:CW0014S)。ECL化學發光檢測試劑盒購自蘇州UElandy公司(貨號:S6009M).熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司(型號:CX-1)。流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特生命科學公司(型號:CytoFLEX S)。CO2培養箱購自美國Thermo公司(型號:Forma 3111)。人胰腺癌SW1990細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 ①GEPIA數據庫分析RAB10在胰腺癌及正常胰腺組織中的基因表達差異:在GEPIA數據庫中條件設置為:“gene:RAB10”、“cancer type:PAAD”,“Match TCGA normal and GTEx data”可獲得RAB10在正常胰腺組織與胰腺癌組織中的表達差異。② 不同RAB10mRNA表達水平胰腺癌患者的相關臨床數據收集與分析:下載癌基因數據庫TCGA中RAB10在胰腺癌中的基因表達量和臨床相關性數據,將RAB10mRNA表達量的中位數定為分界線,把胰腺癌患者分為RAB10低表達組和RAB10高表達組,并對臨床相關數據進行統計分析。

1.2.2細胞的培養、轉染與檢測 ① 細胞的培養:將SW1990細胞系培養于DMEM培養基(其中含10%的FBS),放置在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h,至細胞達到80%～90%融合度;② 細胞轉染:將細胞懸液接種于培養板,待接種細胞貼壁后,將過表達RAB10質粒轉染至SW1990細胞作為實驗組(RAB10-OE),將空質粒轉染SW1990細胞作為其對照組(pcDNA3.1);針對RAB10序列合成3條小干擾RNA(siRNA)分別轉染SW1990細胞作為實驗組(RAB10-siRNA-1、2、3),將隨機陰性對照序列siRNA作為其對照組(NC-siRNA)。③ 細胞的檢測:使用Q-PCR實驗檢測沉默效果及過表達效果,挑選干擾效果最好的siRNA進行后續實驗。使用BCA、ECL試劑盒按說明書進行Western blot實驗,檢測蛋白表達情況。

1.2.3EdU細胞增殖實驗 在24孔板中鋪板,接種轉染后的四組細胞并配制20 μmol/L EdU工作液,將上述EdU工作液預熱至37 ℃,濃度稀釋至10 μmol/L,繼續培養細胞,將EdU工作液加入細胞中,待EdU標記完成后加入固定液固定15 min,去除固定液,使用PBS洗滌細胞后加入通透液繼續培養15 min,去除通透液,每孔加入0.5 ml Clik反應液,避光培養30 min后洗滌細胞,每孔加入10 μmol/L Hoechst 33342溶液1 ml,培養10 min后洗滌,完成核染色。在熒光顯微鏡下對細胞進行拍照和處理數據,該實驗重復3次。

1.2.4流式細胞實驗 調整轉染后四組細胞的濃度為5×105～1×106個/ml。吸取上述1 ml細胞,4 ℃、1 000 r/min離心機離心10 min后去除上清液。加入預冷PBS液1 ml,輕搖試管使細胞懸浮,4 ℃、1 000 r/min離心機離心10 min,去除上清液,若存在貼壁細胞,則先用胰酶消化,再加入PBS洗滌處理。將細胞重懸于200 μl Binding Buffer緩沖液中,向上述液中加入10 μl PI 與10 μl Annexin V-FITC,輕晃混勻液體,避光在室溫下反應15 min后再加入300 μl Binding Buffer緩沖液。使用流式細胞儀檢測,該實驗重復3次。使用FlowJo 10處理數據作圖。

1.2.5Transwell實驗 Transwell小室放置于24孔板中。將無血清的L15與Matrigel膠按8 ∶1稀釋至60 μl,置入培養箱中5 h后,待上室膠凝固并吸除殘余液體,再加入100 μl的無血清L15培養基,放入培養箱中水化20 min。胰酶消化轉染后的四組細胞,把無血清L15重懸制備成細胞懸液,使用血球計數板計數。取上述1×104個實驗細胞接種至上室,含有10%FBS的L15培養基接種于下室。放入37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。待24 h后吸干孔板里面的培養基,再使用4%的多聚甲醛固定20 min、結晶紫染色25 min,最后使用PBS清洗3次,在顯微鏡下拍照。該實驗重復3次。

1.2.6劃痕實驗 接種約5×105個轉染后的四組細胞至6孔板;24 h貼壁后用使用移液器槍頭對著直尺進行劃線,使用PBS沖洗細胞3次,除去劃下的細胞,加入L15培養基、FBS血清,置入37 ℃、 5% CO2培養箱中培養。于培養的0 、24、48 h時顯微鏡下拍照。該實驗重復3次。

2 結果

2.1 胰腺癌組織及正常胰腺組織中的RAB10mRNA表達情況GEPIA數據庫共包含171個正常胰腺組織樣本及179個胰腺癌組樣本。結果顯示胰腺癌組織中RAB10mRNA的表達量明顯高于正常胰腺組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 RAB10在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達比較

2.2細胞轉染效果驗證Q-PCR實驗結果如圖2A、B所示,在SW1990細胞中,RAB10mRNA表達在siRNA-1組與siRNA-2組中明顯降低(tsiRNA-1=13.494,tsiRNA-2=19.939,均P<0.001;tsiRNA-3=0.78,P=0.48),且siRNA-2組沉默效果更好,故后續實驗均選用siRNA-2組;RAB10-OE組RAB10mRNA表達明顯高于pcDNA3.1組(t=23.08,P<0.01);Western blot實驗結果如圖2C所示,與NC-siRNA組比較,RAB10-siRNA1、2、3組蛋白表達量均減少,其中RAB10-siRNA-2減少最明顯;與pcDNA3.1組比較,RAB10-OE組蛋白表達量增加。表示均轉染成功。

圖2 RAB10 mRNA表達和蛋白表達

2.3RAB10對細胞增殖的影響如圖3所示,與NC-siRNA組相比,RAB10-siRNA-2組SW1990細胞的增殖能力明顯降低(t=32.03 ,P<0.000 1);與pcDNA3.1組相比, RAB10-OE組SW1990細胞的增殖能力明顯升高(t=8.02,P=0.001 3)。表明沉默RAB10能夠抑制SW1990細胞的增殖,過表達RAB10能夠促進SW1990細胞的增殖。

圖3 各組細胞的細胞增殖率

2.4RAB10對細胞凋亡的影響如圖4所示,與NC-siRNA組相比, RAB10-siRNA-2組SW1990細胞的凋亡細胞數量明顯增加(t=35.73,P<0.01);與pcDNA3.1組相比,RAB10-OE組SW1990細胞的凋亡細胞數量明顯減少(t=21.39,P<0.001)。表明沉默RAB10能夠增強SW1990細胞的凋亡,過表達RAB10能夠抑制SW1990細胞的凋亡。

圖4 各組細胞凋亡情況

2.5RAB10對細胞侵襲能力的影響如圖5所示,與 NC-siRNA 組相比, RAB10-siRNA-2組SW1990細胞的侵襲能力明顯降低(t=11.01,P=0.000 4);與pcDNA3.1組相比, RAB10-OE組SW1990細胞的侵襲能力明顯增強(t=7.18,P=0.002)。表明沉默RAB10能夠抑制SW1990細胞的侵襲能力,過表達RAB10能夠增強SW1990細胞的侵襲能力。

圖5 各組細胞侵襲能力

2.6RAB10對細胞遷移能力的影響實驗結果如圖6、表1所示,與NC-siRNA組相比,RAB10-siRNA-2組SW1990細胞的遷移能力明顯減弱(48 h:t=33.94,P<0.001);與pcDNA3.1組相比, RAB10-OE組SW1990細胞的遷移能力明顯增強(48 h:t=61.46,P<0.001)。表明沉默RAB10抑制SW1990細胞的遷移能力,過表達RAB10增強SW1990細胞的遷移能力。

表1 劃痕實驗未遷移率(n=3)

圖6 各組細胞遷移能力 ×40

2.7RAB10mRNA表達水平與胰腺癌患者預后的關系根據癌癥基因數據庫TCGA中下載的RAB10臨床相關數據進行統計學分析,將RAB10mRNA表達量的中位數定為分界線,把胰腺癌患者分為RAB10低表達組和RAB10高表達組。利用Kaplan-Meier法繪制胰腺癌患者生存曲線圖。結果如圖7所示,RAB10低表達組生存時間明顯高于RAB10高表達組(1 059 dvs485 d,χ2=14.420,P<0.001)。Log-rank檢驗結果顯示RAB10低表達組生存時間明顯高于RAB10高表達組(P<0.001)。

圖7 RAB10高、低表達組生存時間與生存率的關系

2.8Cox單因素、多因素回歸分析結果下載TCGA

數據庫中胰腺癌臨床數據,將胰腺癌患者臨床病理特征進行Cox回歸分析。結果顯示,臨床分級、T分期、M分期及RAB10mRNA表達水平與胰腺癌患者生存時間明顯相關(均P<0.05)。將具有統計學意義的單因素Cox回歸分析影響因素納入多因素Cox回歸分析,結果顯示,RAB10mRNA的表達水平為影響胰腺癌患者生存時間的唯一獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 Cox回歸分析RAB10mRNA表達水平與胰腺癌患者生存時間的關系

3 討論

惡性腫瘤具有細胞分化和增殖異常、生長失去控制、浸潤性和轉移性等生物學特征,其發生是一個多因子、多步驟的復雜過程。人體中幾乎所有的細胞都可能由于突變而發生改變,從而發展成癌癥,其中基因突變是重要的影響因素。同時惡性腫瘤的發生是癌細胞不受人體調節機制控制,逐漸侵襲正常組織的漸進過程。上述過程往往受到原癌基因以及抑癌基因的調控。

RAB10是一種蛋白質編碼基因,其編碼的GTP結合蛋白RAB10屬于RAS超家族的小GTP酶。RBA10主要分布于胞吐、胞吞區室,介入調節細胞內囊泡運輸,是細胞內膜運輸的關鍵調節因子,參與從運輸囊泡的形成到與膜的融合。RAB10在Rabs活性GTP結合形式與非活性GDP結合形式之間循環,能夠將直接負責囊泡形成,運動,拴系和融合的不同下游效應子集招募到膜中[11]并參與信號轉導、細胞凋亡[12],影響細胞增殖和腫瘤進展。這種調控因子的作用使得RAB10具有潛在的研究價值。

本研究通過生信分析顯示RAB10mRNA的表達水平與胰腺癌患者的生存時間相關,RAB10高表達患者的生存時間明顯降低,在單因素Cox回歸分析中顯示RAB10mRNA表達水平與胰腺癌患者臨床分級、T分期、M分期相關,多因素Cox回歸分析顯示出RAB10mRNA表達水平是胰腺癌患者預后的獨立危險因素。Wang et al研究[9]表明RAB10低表達的肝癌患者生存時間明顯高于高表達患者, Cox回歸分析顯示RAB10高表達是肝癌患者根治術后總生存期的獨立危險因素。Dai et al研究[7]表明RAB10在骨肉瘤細胞中高表達也與患者生存率降低有關, Cox分析顯示RAB10的高表達與骨肉瘤肺轉移以及 TNM 分期呈正相關。國內外文獻與本研究顯示RAB10的表達水平與腫瘤患者的生存期相關。

本研究通過體外細胞實驗顯示RAB10可以促進胰腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移,并誘導其凋亡。Jiang et al研究[13]表明,在骨肉瘤細胞中沉默RAB10能夠明顯抑制腫瘤細胞的生長和遷移。Dai et al[7]發現RAB10在骨肉瘤細胞在骨肉瘤組織中的蛋白表達遠高于非腫瘤性骨組織。Zhang et al[10]發現RAB10在腦膠質瘤細胞中表現出明顯的促進增殖和侵襲能力。本研究的結果顯示,RAB10在胰腺癌中高表達,并且能夠促進胰腺癌細胞的增值、侵襲和遷移能力。因此,RAB10可能與癌細胞的惡性功能相關。

總之,本研究使用癌癥基因數據庫及細胞功能實驗說明了RAB10可能具有促進胰腺癌細胞惡性功能行為的作用。未來將繼續收集胰腺癌患者臨床相關數據進行數據分析,并在公共數據庫數據中驗證,進一步研究RAB10在胰腺癌細胞中可能的調控通路。