穿心蓮內酯調控鐵死亡中SLC7A11/GPX4軸減輕膿毒癥腸損傷

黃 銘,張藝馨,曹國棟,曾佑成,林 靚,王曉悅,程青虹,3

膿毒癥是機體對感染反應失調導致的危及生命的器官功能障礙[1]。在膿毒癥發展過程中,腸道是容易受損的器官之一。鐵死亡是一種鐵依賴性、脂質過氧化物累積誘發的細胞死亡方式,經研究證明可通過抑制鐵死亡保護膿毒癥心臟功能[2],然而鐵死亡對于膿毒癥腸損傷的作用少有研究。穿心蓮內酯(andrographolide,AG)化學式為C20H30O5,具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。而AG通過鐵死亡對腸損傷發揮的作用尚未可知。本實驗通過盲腸結扎穿刺(cecum ligation and puncture,CLP)術構建膿毒癥模型,探討穿心蓮內酯能否通過激活鐵死亡中溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)/谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)軸減輕膿毒癥腸損傷。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑穿心蓮內酯(貨號:365645)及鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1, Fer-1,貨號:347174)購自美國Sigma公司,腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α, TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)試劑盒(貨號:GMP-TL662、GMP-TL652)購自上海語純生物科技公司;腸脂肪酸結合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)、D-乳酸(貨號:SEKM-0239、BC5350)購自北京索萊寶生物技術有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)測定試劑盒(貨號:A003-1-2、A006-2-1)購自南京建成生物工程研究所;鐵離子比色法檢測試劑盒(貨號:E1042)購自北京普利萊生物公司;BCA蛋白含量檢測試劑盒(貨號:P0012S)購自江蘇碧云天生物科技有限公司;兔抗溶質載體家族7成員11(SLC7A11)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、鐵重鏈蛋白1(ferritin heavy chain 1,FTH-1)(貨號:T57046、T56969)購自上海Abmart公司,FTH-1抗體(貨號:ab183781)購自上海Abcam公司,β-actin抗體、山羊抗鼠和山羊抗兔二抗(貨號:GB110010、GB23301、GB23303)購自武漢賽維爾生物技術有限公司。

1.2 主要儀器Z323K低溫離心機(德國HERMILE公司),Elx-800多功能酶標儀(美國Bio-Bad公司),EG1150石蠟包埋機、RM2265輪轉式切片機(德國LEICA公司),CH20光學顯微鏡(日本olympus公司),Tanon-5200 Multi全自動化學發光成像儀(上海天能公司)。

1.3 方法

1.3.1動物分組及模型制備 SPF級雄性SD大鼠80只,體質量(200±25)g,購自新疆醫科大學動物實驗中心,生產許可證編號:SYXK(新)2011-010101,于SPF級動物房由專人予以鼠飼料及水,室內保持通風,相對溫度保持20～25 ℃,相對濕度保持50%～70%,自由進食飲水。本實驗已獲得石河子大學醫學院第一附屬醫院動物實驗倫理委員會批準(編號:A2022-173-01)。將40只SD雄性大鼠隨機分為5組,分別是假手術(sham)組、CLP組、AG低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)[4-5],每組8只;以AG高劑量(AG20)組為最佳劑量組再將其余40只SD雄性大鼠分為sham組、CLP組、AG20組、鐵死亡抑制劑(Fer-1)組[6]、AG20+Fer-1組,每組8只。造模開始前1 h,給藥組予以AG(20 mg/kg)及Fer-1(10 mg/kg)腹腔注射處理,假手術組予以等體積生理鹽水注射。除假手術組外,其余各組均采用CLP建立膿毒癥模型[7],具體操作:術前12 h禁食不禁水,予以戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉,消毒后沿大鼠腹中線切開,找到盲腸拉出腹腔,盲腸根部1/4處結扎,穿刺盲腸末端2次,擠出少量腸內容物,回納盲腸,逐層關腹。假手術組使用相同的操作,不進行結扎及穿孔。術后2 h觀察呼吸頻率、心率、飲食、活動變化等判斷膿毒癥模型是否建立成功。

1.3.2炎癥及腸黏膜通透性檢測 術后24 h取sham組、CLP組、AG低、中、高劑量組腹主動脈血2 ml,離心,取上層血清,按照試劑盒檢測血清中炎癥水平(IL-6、TNF-α)及腸黏膜通透性水平(I-FABP、D-乳酸)。

1.3.3HE染色 取每組距回盲瓣5 cm處腸組織,4%多聚甲醛溶液中固定后切片、脫蠟、染色、封片,于顯微鏡下觀察腸組織損傷情況。依據Chiu′s分級進行評分,Chiu′s分級[8]具體評分如下:小腸黏膜、絨毛正常(0分);在絨毛頂端中出現腸黏膜上皮下間隙擴大,常伴有毛細血管充血,炎細胞浸潤(1分);腸上皮下間隙顯著擴張,絨毛頂端上皮抬高與固有層中度分離(2分);固有層大量分離,部分絨毛頂端脫落(3分);絨毛及固有層脫落,毛細血管擴張(4分);固有層消化或破壞,伴出血或潰瘍(5分)。

1.3.4透射電鏡檢測腸組織病理變化 取sham組、CLP組、AG20組、Fer-1組、AG20+Fer-1組大鼠腸組織于電鏡固定液固定后經過包埋、脫水、切片及染色后在透射電鏡下觀察腸組織病理變化。

1.3.5氧化應激水平檢測 取sham組、CLP組、AG20組、Fer-1組、AG20+Fer-1組腸組織進行反復研磨后取上清液,參照試劑盒說明書對上清液進行MDA、GSH含量測定。

1.3.6Fe3+檢測 取sham組、CLP組、AG20組、Fer-1組、AG20+Fer-1組腸組織進行反復研磨后取上清液,參照試劑盒說明書對上清液進行Fe3+含量測定。

1.3.7Western blot 取sham組、CLP組、AG20組、Fer-1組、AG20+Fer-1組腸組織勻漿上清液蛋白,BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后,進行SDS-PAGE電泳,轉膜,封閉,并與SLC7A11、GPX4和β-actin一抗(1 ∶1 000) 4 ℃孵育過夜。第2天,洗膜3次,室溫孵育抗鼠或抗兔二抗(1 ∶10 000)1 h,洗膜3次后使用ECL化學發光液顯影。采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值,以β-actin為內參,計算目的蛋白相對表達水平。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結果

2.1 AG對膿毒癥大鼠炎癥指標及腸黏膜通透性的影響如圖1,與sham組相比,CLP組血清IL-6、TNF-α、IFBP、D-乳酸水平明顯升高(tIL-6=28.70,tTNF-α=37.75,tIFBP=24.06,tD-乳酸=25.28,均P<0.05);與CLP組相比AG 5、10、20 mg/kg組血清IL-6(t5 mg/kg=7.15,t10 mg/kg=11.64,t20 mg/kg=17.42,均P<0.05)、TNF-α(t5 mg/kg=9.09,t10 mg/kg=14.77,t20 mg/kg=21.05,均P<0.05)、IFBP(t5 mg/kg=4.10,t10 mg/kg=8.98,t20 mg/kg=15.89,均P<0.05)、D-乳酸(t5 mg/kg=4.86,t10 mg/kg=10.31,t20 mg/kg=15.43,均P<0.05)水平均逐步降低,呈濃度依賴性(趨勢性檢驗P<0.05)。提示AG可降低炎癥及腸黏膜通透性,且高濃度組效果最佳。

圖1 AG對膿毒癥大鼠IL-6、TNF-α、IFABP、D-乳酸的影響

2.2 AG對膿毒癥大鼠腸組織形態學變化的影響如圖2所示,sham組腸黏膜絨毛排列整齊,無明顯病理學改變;與sham組相比,CLP組絨毛可見斷裂及脫落,毛細血管擴張及炎細胞浸潤明顯,固有層明顯破壞,Chiu’s評分降低(t=34.80,P<0.05);與CLP組相比,AG組腸絨毛脫落逐步好轉,毛細血管擴張及炎細胞浸潤逐步改善,固有層增生和破壞減輕, AG20組改善最為明顯(tAG 5 kg/mg=4.85,tAG 10 kg/mg=8.39,tAG 20 kg/mg=13.53,均P<0.05)。

圖2 各組大鼠腸組織形態變化及Chiu′s評分 HE ×100

2.3 AG對膿毒癥大鼠腸組織絨毛及線粒體變化的影響以AG20組為最佳劑量組進行研究,如圖3A所示,在光鏡下AG20組和Fer-1組較CLP組相比腸絨毛排列稍整齊,毛細血管擴張減輕,固有層增生及破壞明顯好轉,Chiu’s評分明顯降低(tAG20=11.87,tFer-1=9.33,P<0.05);與AG20組、Fer-1組分別相比,AG20+Fer-1組腸絨毛頂端破壞少,未見明顯固有層的增生及破壞,Chiu’s評分降低(t=9.23,t=11.7,P<0.05)。如圖3B所示,在電鏡下可見sham組腸上皮絨毛結構清晰完整,排列整齊,線粒體無明顯改變;CLP組絨毛排列不齊,可見斷裂、缺失,線粒體數量減少,空泡樣改變嚴重;AG20組及Fer-1組絨毛排列稍齊,斷裂及缺失減少,線粒體空泡稍有改善;而 AG20+Fer-1組腸組織結構破損改善更為明顯。

圖3 各組大鼠腸組織光鏡和透射電鏡下形態變化圖及Chiu′s評分

2.4 AG對膿毒癥大鼠腸組織氧化應激水平的影響以AG20組為最佳劑量組進行研究,如圖4所示,與sham組相比,CLP組腸組織中MDA含量明顯升高(t=24.57,P<0.05),GSH含量明顯降低(t=31.49,P<0.05);與CLP組相比,AG20組及Fer-1組腸組織中MDA含量明顯降低(tAG20=9.55,tFer-1=13.21,P<0.05),GSH含量明顯升高(tAG20=11.83,tFer-1=13.70,P<0.05);與AG20組、Fer-1組分別相比,AG20+Fer-1組腸組織氧化應激水平下降更為明顯(MDA:t=9.87,t=6.21;GSH:t=6.34,t=4.47,均P<0.05)。

圖4 不同濃度AG對膿毒癥大鼠腸黏膜氧化應激水平的影響

2.5 AG對膿毒癥大鼠腸組織Fe3+含量的影響以AG20組為最佳劑量組進行研究,如圖5所示,與sham組(4.95±0.78)相比,CLP組腸組織中Fe3+含量(38.86±2.79)明顯升高(t=23.81,P<0.05);與CLP組相比,AG20組及Fer-1組腸組織中Fe3+含量(27.53±2.26、23.86±1.51)明顯降低(t=7.95,t=10.53,P<0.05);與AG20組、Fer-1組分別相比,AG20+Fer-1組腸組織中Fe3+含量(13.02±2.13)降低更明顯(t=10.19,t=7.61,P<0.05)。

圖5 不同濃度AG對膿毒癥大鼠腸黏膜Fe3+含量的影響

2.6 AG對膿毒癥大鼠腸組織SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白表達水平的影響以AG20組為最佳劑量組進行研究,如圖6所示,與sham組相比,CLP組腸組織中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量明顯降低(tSLC7A11=18.86,tGPX4=38.57,tFTH-1=26.65,P<0.05);與CLP組相比,AG20組(tSLC7A11=3.88,tGPX4=22.89,tFTH-1=4.48)及Fer-1組(tSLC7A11=3.47,tGPX4=24.90,tFTH-1=4.72)腸組織中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量均明顯升高;與AG20組、Fer-1組分別相比,AG20+Fer-1組腸組織中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量升高更明顯(SLC7A11:t=3.87,t=4.28;GPX4:t=8.21,t=6.19;FTH-1:t=6.10,t=6.34;均P<0.05)。

圖6 各組大鼠腸組織SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白表達水平

3 討論

膿毒癥是由免疫紊亂、器官功能失調、炎癥風暴等原因誘發多器官功能障礙,肺臟、腎臟、肝臟等器官均可產生病變,從而危及生命[9]。隨著研究不斷深入,膿毒癥并發腸損傷也受到越來越多的關注。腸道微生態失衡、線粒體功能障礙、異常腸道細胞死亡等機制均可誘發膿毒癥腸損傷的發生[10]。本研究中膿毒癥組大鼠腸黏膜結構破壞,病理學損傷明顯,發生嚴重的炎癥反應,腸黏膜通透性明顯增加,提示膿毒癥發生時伴有腸道損傷。具有抗氧化、抗炎、抗病毒等廣泛藥理活性的AG對膿毒癥腸損傷的影響報道尚少,本研究對于同樣實施了CLP術但經過AG給藥后,可見腸黏膜病理損傷逐步改善,炎癥反應和氧化應激均有所降低,且劑量越高,作用越明顯,均揭示AG對膿毒癥腸道起保護作用,但AG對于膿毒癥腸損傷的保護作用是通過何種方式起效的,尚無人進行探究。

鐵死亡為近年來發現的新型細胞死亡方式,被證實參與膿毒癥心臟[11]器官損傷。當鐵死亡加重時,細胞內鐵累積引起毒性脂質過氧化物ROS的升高,氧化應激水平增高,鐵重鏈蛋白(FTH-1)表達減少。本研究中膿毒癥組加入分別加入Fer-1及AG后,Fe3+含量降低,FTH-1蛋白表達提高,抗氧化作用增強,且AG和Fer-1共同作用時上述效果更明顯,直接證明了鐵死亡不僅參與更是促進了膿毒癥腸損傷的發生,而AG可通過減輕鐵死亡發揮保護作用。

SLC7A11是System Xc-系統發揮功能的主要亞基,此亞基主要作用是將胞外胱氨酸及胞內谷氨酸以1 ∶1比例交換,使胞內有充足的半胱氨酸來合成GSH,GSH可與GPX4協同將胞內脂質氧化物轉化為無毒的脂質醇,以減少細胞內脂質氧化物的累積,從而抑制鐵死亡的發生發展,減輕組織損傷[12-13]。本研究CLP組中SLC7A11、GPX4表達均受到抑制,腸組織損傷嚴重,加入AG及Fer-1后SLC7A11、GPX4蛋白表達增加,腸組織損傷得到修復。AG和Fer-1聯用時,鐵死亡進一步受到抑制,出現了更強大的抗炎癥、抗氧化功能,修復腸組織損傷作用,這可能與AG激活鐵死亡中SLC7A11/GPX4軸改善膿毒癥腸損傷有關。

綜上所述,穿心蓮內酯可能通過調節SLC7A11/GPX4軸來抑制鐵死亡的發生,從而改善膿毒癥大鼠腸損傷。但關于穿心蓮內酯是否可以通過SLC7A11/GPX4軸的上游及下游調控靶點控制鐵死亡誘導膿毒癥腸損傷的發生尚有待深究,未來將在后面的研究中進一步探索。