丹黃散激活PINK 1/Parkin信號通路對高糖誘導的血管內皮細胞損傷的影響

范 燚,張春玲,趙 偉,陳 露,邸鐵濤,周世勇,魏良綱,張 艷,董源源

糖尿病潰瘍(diabetic ulcers,DUs)作為一種慢性、難愈性疾病,是糖尿病的常見并發癥之一。DUs的發病機制復雜,傳統治療方法傷口愈合緩慢、治療時間長、治療成本高,給患者帶來痛苦[1]。尋找有效可行的干預靶標,成為相關領域的研究熱點和難點。血管內皮細胞長期暴露與于高糖環境下,易出現炎癥損傷,從而導致血管病變[2]。線粒體自噬通過自噬方式靶向選擇性清除功能受損的線粒體,從而維持線粒體功能網絡動態平衡。研究[3]表明,線粒體自噬水平降低,且與其它機制的交互作用是DUs難愈合的關鍵原因之一。磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)誘導假定激酶(PTEN induced putative kinase,PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)通路通過調控自噬可識別并清除受損的線粒體,是目前較公認的自噬途徑,被廣泛用來評估自噬水平[4]。丹黃散是由丹參、大黃、當歸、沒藥、沉香、松香幾味藥物組成的復方散劑,具有活血化瘀、祛腐生肌、利濕解毒之功效。前期研究[5]顯示,丹黃散具有促進糖尿病大鼠潰瘍愈合的效果,可促進創面肉芽組織生長,然而其作用機制尚未明確。該研究以PINK 1/Parkin通路介導的線粒體自噬為靶向,探究丹黃散對高糖誘導的血管內皮細胞損傷的影響,并探討其是否能通過Pink1/Parkin信號通路介導的線粒體自噬,維持創面細胞線粒體正常結構與功能,促進DUs創面愈合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞 人臍靜脈血管內皮細胞(貨號:DFSC-EC-01)購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2實驗藥物 丹黃散為貴州中醫藥大學第二附屬醫院院內制劑(黔藥制字Z 03 100 240)。方中藥物大黃、丹參、當歸、沉香、松香、沒藥均由院內藥劑科按照2020年版《中國藥典》標準進行采購,按照比例混合經30 B粉碎機物理粉碎后充分混勻,取得的中藥粉末以能過120目篩為宜,用60 Co-γ輻照滅菌處理,用無菌水調和。重組人表皮生長因子凝膠(以下簡稱生長因子),國藥準字S 20020123,購自桂林華諾威基因藥業有限責任公司,規格為10 g/支。

1.1.3主要試劑和儀器 葡萄糖(貨號:H 42021168)購自湖北科倫藥業有限公司;山羊血清封閉液(貨號:SL 038)購自北京Solarbio公司;胎牛血清(貨號:12483020)購自美國Gibco-BRL公司;Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(貨號:ZF-0511)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(貨號:ZB-2301)、熒光封片劑(含DAPI)(貨號:ZLI-9557)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Anti-PINK 1抗體(貨號:DF 7742),Anti-LC 3-Ⅱ(貨號:AF 4650),購自美國Affinity公司;Anti-Parkin抗體(貨號:66674-1-Ig)、Anti-Bcl2抗體(貨號:68103-1-Ig)、anti-Beclin1抗體(貨號:11306-1-Ap)、Anti-Bax抗體(貨號:60267-1-Ig)、β-actin(貨號:81115-1-RR)均購自武漢三鷹公司;BCA 蛋白定量試劑盒(貨號:33267)購自珠海貝索生物技術有限公司;Transwell上小室(貨號:3422)購自美國康寧公司;結晶紫(貨號:C196471)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;30 B粉碎機(型號:GMP30B)購自常州市久川干燥設備有限公司;顯微鏡(型號:BX53)、倒置熒光顯微鏡(型號:IX51)均購自日本OlymPus公司;移液槍購自德國EPPendorf公司;免疫組化筆(型號:ZLI-9305)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;二氧化碳細胞培養箱(型號:HF90)購自上海力申科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及分組 將人臍靜脈血管內皮細胞在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養,每2～3 d傳代1次,使用第3代細胞展開實驗。探索丹黃散對血管內皮細胞作用效果。將實驗分組為:對照組、生長因子組、丹黃散組、高糖組、高糖+生長因子組、高糖+丹黃散組,每組3 例。對照組加入10%空白血清,在對照組基礎上,生長因子組加入生長因子,丹黃散組加入10%丹黃散,高糖組加入30 mmol/L葡萄糖,高糖+生長因子組加入30 mmol/L葡萄糖和生長因子,高糖+丹黃散組加入30 mmol/L葡萄糖和10%丹黃散。

1.2.2細胞劃痕實驗檢測細胞轉移率 將6 組細胞分別置于6孔板中,培養24 h,待細胞融合到90%后,用移液槍垂直于細胞培養盤底部緩慢劃痕;PBS清洗3次,在細胞培養箱中繼續培養,在倒置熒光顯微鏡下分別于0、48 h觀察并記錄劃痕距離,計算細胞轉移率。細胞轉移率=(0 h劃痕距離-48 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞侵襲 取6 組細胞懸液接種到鋪有基質膠的Transwell上室,放入培養箱中繼續培養48 h,4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色10 min,PBS清洗3次,倒置顯微鏡下隨機選取5個視野,記錄侵襲細胞數。細胞侵襲率=侵襲細胞數/細胞總數×100%。

1.2.4免疫熒光試驗檢測抗凋亡蛋白Bcl-2、Beclin-1、促凋亡蛋白Bax的蛋白表達情況 取6 組細胞進行爬片,PBS浸洗、室溫、封閉后,加入3% BSA稀釋的一抗Anti-Bcl-2(1 ∶100)、anti-Beclin1(1 ∶100)、Anti-Bax(1 ∶100),4 ℃濕盒內孵育過夜,PBS浸洗3次,滴加稀釋好的熒光二抗(Alexa Fluor?488標記山羊抗兔IgG,1 ∶100),37 ℃濕盒孵育1 h,PBS漂洗3 次,DAPI核染5 min,去離子水漂洗,封片,在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5Western blot技術檢測PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達情況 取各組處于對數生長期的細胞,PBS清洗2次,加入細胞裂解液,離心后取上清液,BCA法測定總蛋白濃度,蛋白變性、上樣、電泳、轉膜,加入一抗Anti-PINK 1(1 ∶1 000)、Anti-Parkin(1 ∶1 000)、Anti-LC 3-Ⅱ(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,次日復溫,加二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG,1 ∶5 000),37 ℃孵育1 h,TBS洗膜3次,ECL暗室曝光顯影。以β-actin為內參,采用ImageJ圖像分析軟件進行灰度值分析。灰度值=目的條帶/β-actin。

2 結果

2.1 6組細胞轉移率、侵襲率的情況方差分析發現,6組細胞的轉移率、侵襲率差異具有統計學意義(F=31.077、108.281;P<0. 001)。兩兩比較結果顯示,與對照組、生長因子組相比,丹黃散組細胞轉移率、侵襲率降低(t=7.708、4.396、25.118、9.320;均P<0. 05);與高糖組、高糖+生長因子組相比,高糖+丹黃散組細胞轉移率、侵襲率降低(t=9.120、3.828、11.678、8.374;均P<0. 05)。見表1、圖1。說明丹黃散降低能夠降低高糖誘導細胞的細胞轉移率、侵襲率。

圖1 6組細胞增殖的劃痕距離和侵襲能力的比較

表1 6組細胞增殖轉移率、侵襲率的比較

2.2 6組細胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Beclin-1、促凋亡蛋白Bax的蛋白表達情況方差分析顯示,6組細胞的Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白表達差異具有統計學意義(F=17.564、19.956、40.108,均P<0. 05)。兩兩比較結果顯示,與對照組、生長因子組相比,丹黃散組Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平升高(t=-6.161、-6.095、-5.804、-3.885;P<0.05), Bax的蛋白水平降低(t=10.823、5.473;P<0.05)。與高糖處理后的高糖組、高糖+生長因子組相比,高糖+丹黃散組細胞Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平仍升高(t=-6.722、-3.330、-7.195、-3.921;P<0.05), Bax的蛋白水平仍降低(t=8.125、7.899;P<0.05)。見表2、圖2。說明丹黃散可上調Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平,下調Bax的蛋白水平。

圖2 6組細胞Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白表達的免疫熒光圖 ×200

表2 免疫熒光試驗檢測6 組細胞Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白的表達水平

2.3 Western blot檢測6組細胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達情況方差分析發現,6組細胞的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達差異具有統計學意義(F=128.504、101.518、66.948,均P<0. 001)。兩兩比較結果顯示,與對照組、生長因子組相比,丹黃散組的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達明顯增高(t=-14.717、-9.682、-12.135、-11.502、-11.501、-5.765;均P<0.05);與高糖組、高糖+生長因子組相比,高糖+丹黃散組細胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達仍升高(t=-22.045、-6.197、-12.244、-7.521、-10.954、-6.245;均P<0. 05)。見表3、圖3。說明丹黃散可明顯提升高糖處理細胞的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表達水平。

圖3 Western blot檢測6組細胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白的表達水平

表3 Western blot檢測6 組細胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白的表達水平

3 討論

DUs與周圍血管損傷密切相關,研究[6]發現,DUs的難愈性與肉芽組織的微血管再生能力降低以及血管生成不良導致的營養供應減少密切相關,促進創面局部血管生成能夠在一定程度上改善糖尿病潰瘍的愈合障礙。長期高血糖水平和內皮細胞功能障礙是造成周圍血管損傷和血管新生困難導致的DUs創面愈合困難的重要原因[7]。因此,在嚴格控制血糖的同時對血管內皮細胞進行有效保護是預防和治療DUs的關鍵。研究[8]發現,高糖會加重細胞氧化應激反應,增加細胞遷移能力和局部侵襲能力。有效抑制高糖狀態下的細胞遷移對于阻止疾病進展至關重要。

線粒體自噬對維護細胞內環境穩定起著重要作用,是細胞內一種適應性保護機制,激活血管內皮細胞內線粒體自噬水平可降低細胞凋亡,促進其分化、增殖和遷移[9]。磷酸酯酶與PTEN誘導PINK1/Parkin信號通路是調控線粒體自噬的重要途徑,Parkin是一種E3泛素連接酶,能夠調控蛋白降解及信號轉導,促進自噬體吞噬線粒體,PINK 1具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性,作為線粒體膜電位變化感受器,在生理狀態下,PINK 1導入線粒體基質被泛素蛋白酶體系統降解,并與Parkin相互作用抑制其向線粒體的轉運,維持自噬正常水平[10]。Xi et al[11]研究發現,黃芩素可通過上調 PINK 1/Parkin信號通路調節線粒體自噬,有效保護高糖損傷的血管內皮細胞;上調糖尿病小鼠血管壁PINK 1和Parkin蛋白可誘導線粒體自噬,保護線粒體完整性,減緩血管內皮損傷。由此可見,PINK 1可以通過PINK 1/Parkin信號通路保護血管內皮細胞。PINK 1充當線粒體自噬的“監測者”觸發線粒體自噬的起始信號,Parkin作為線粒體自噬信號的“增強子”介導底物泛素化,與Beclin-1和微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC 3-Ⅱ)結合后形成自噬小體,降解受損線粒體。細胞凋亡途徑主要依賴線粒體并受線粒體蛋白(Bcl-2家族蛋白)的調節,細胞凋亡時會伴隨Bax結合線粒體復合物,抗凋亡蛋白Bcl-2可有效抑制線粒體上的促凋亡蛋白復合體形成[12]。

“祛腐生肌”是難愈性創面的主要治療方法之一,丹黃散秉承“祛腐生肌”理念,集祛腐與生肌作用于一體。研究[13]表明丹黃散能夠促進糖尿病大鼠潰瘍創面毛細血管新生,加速傷口愈合。本研究發現丹黃散對高糖誘導的血管內皮具有一定保護作用,可降低細胞侵襲與轉移,并激活PINK 1/Parkin信號通路,上調Beclin-1、LC 3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達,下調Bax的表達,提高線粒體自噬水平。本研究選擇的信號通路有大量的上游和下游調控因子,未來工作中可以進行更深層次的研究。