m6A甲基化修飾在腎細胞癌中的研究進展

徐麗秀,倪偉建,王 偉,侯冰冰 綜述 郝宗耀,溫家根 審校

腎癌在我國泌尿生殖系統腫瘤中占第2位,僅次于膀胱癌,每年全球新增病例超過40萬例,發病率仍在逐年上升[1]。腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是腎癌中最常見的惡性腫瘤,約占90%左右。由于腎癌早期無明顯臨床癥狀,通過腎臟彩超、CT和核磁共振才可診斷,因此腎癌發現時往往已出現遠端轉移[2]。早期RCC以手術治療為主,約30%～50%的患者手術切除原發腫瘤后出現遠端轉移,晚期和轉移性RCC則以藥物治療為主,但傳統化療和放療效果不佳,預后較差[3],因此亟須探索新的治療方法。

近年來,以m6A甲基化修飾為主的表觀遺傳學研究已成為生物醫學領域的研究熱點,尤其在腫瘤方面。研究顯示,m6A甲基化修飾與RCC間存在密切聯系[4]。為探討m6A甲基化修飾在RCC中的治療潛力,該文回顧了m6A甲基化修飾相關調控因子與RCC疾病進程的關系,并總結了這些調控因子在RCC中的作用及機制,旨在為后續的研究提供基礎和方向。

1 m6A甲基化修飾概述

m6A甲基化(N6-methyladenosine,m6A)修飾是在mRNA中腺苷酸的第6位氮原子上發生的甲基化[5],是真核細胞RNA中最常見、最豐富且影響較大的修飾類型[6]。m6A甲基化修飾過程參與了RNA加工、核輸出、翻譯調控和衰變等過程[7],并與腫瘤、心腦血管疾病、中樞神經系統疾病、代謝性疾病等多種疾病的發生發展密切相關[8]。m6A RNA的甲基化修飾過程與DNA甲基化過程類似,是動態、可逆的,由m6A甲基轉移酶復合物、去甲基轉移酶和閱讀蛋白協同完成(圖1)。

圖1 m6A甲基化修飾的分子機制

1.1 甲基轉移酶m6A甲基化由甲基轉移酶復合物催化,使S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)的甲基轉移至受體腺嘌呤第6位氮原子上[9]。甲基轉移酶復合物的核心成分是甲基轉移酶樣3蛋白(methyltransferase-like 3,METTL3),其結構中的甲基轉移酶結構域是與SAM結合的必需結構[10];另一個核心成分是甲基轉移酶樣14蛋白(methyltransferase-like 14,METTL14),其與METTL3以1 ∶1復合,METTL3作為催化核心,而METTL14作為RNA底物結合的結構支撐;作為輔助因子的腎母細胞瘤1-相關蛋白(wilm tumor 1 associated protein,WTAP),由于缺乏甲基化結構域,本身對m6A修飾無催化作用,與METTL3-METTL14形成三元復合物能夠影響m6A甲基轉移酶的富集能力[11]。其他的甲基轉移酶還包括:METTL3同源物METTL5、METTL16、METTL24、病毒樣m6A甲基轉移酶相關蛋白(KIAA1429)、鋅指CCCH結構域蛋白13、RNA結合基序蛋白15(RNA-binding motif protein 15,RBM15)及其副產物RBM15B[12]。

1.2 去甲基轉移酶m6A去甲基轉移酶可去除m6A甲基化,與m6A甲基化形成動態可逆過程。目前已被鑒定的去甲基轉移酶主要有脂肪和肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)和ALKB同系物1/3/5(ALKB homolog 1/3/5,ALKBH1/3/5),二者同屬于α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶家族,但參與的生物學過程有所不同,FTO主要影響RNA的剪切和穩定性,而ALKBH5主要影響RNA的代謝、組裝及核輸出[13]。

1.3 閱讀蛋白閱讀蛋白是能特異性識別并結合至靶RNA的一類蛋白,包括含YTH結構域蛋白(YTHDC)和YTH結構域家族蛋白(YTHDF)亞型,如YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。YTHDC1是m6A修飾中唯一定位于細胞核內的YTH家族甲基結合蛋白,影響RNA的核定位、剪切和核輸出[14];YTHDC2通過直接與m6A修飾位點結合促進翻譯[15];YTHDF1通過與翻譯起始因子結合,提高發生m6A修飾的RNA翻譯效率;YTHDF2則主要影響m6A修飾的RNA衰變;而YTHDF3作為輔助因子,既可與YTHDF1協同促進RNA翻譯,亦可與YTHDF2協同促進衰變[16]。另一類閱讀蛋白是IGF2BPs家族,主要參與RNA的核定位、輸出和翻譯,并在生長發育及代謝方面發揮作用[17]。

2 m6A甲基化與RCC的關系

基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)和基因綜合表達數據庫的分析顯示[18],多個參與m6A甲基化修飾的調控因子在RCC組織和正常組織中差異表達,并在RCC的病理分期和預后預測中具有重要價值,如表1所示。

表1 m6A修飾在RCC中的作用及分子機制

2.1 甲基轉移酶與RCC的關系Wang et al[19]研究發現包括WTAP等在內的m6A甲基化調節因子與ccRCC進展和預后相關,并發現METTL3和METTL14是ccRCC的獨立預后預測因子。研究顯示,METTL3[20]、METTL5[21]和WTAP[22]在腎癌患者的腫瘤組織中表達上調,表達量與腫瘤大小和TNM分期呈正相關,晚期患者的METTL3[23]、METTL5和WTAP[24]的表達水平更高,生存率更低,提示其在RCC中的致癌作用。

經TCGA數據庫和臨床樣本分析顯示,METTL14在RCC組織[25]、METTL24在ccRCC[26]組織中的表達下調,表達水平與腫瘤大小、病理分級和轉移率呈負相關。Zhang et al[27]揭示轉移性RCC組織樣本中METTL14表達明顯低于原發RCC組織,提示METTL14與RCC轉移之間的關系。Cai et al[28]發現METTL24表達水平與癌癥患者預后相關,可作為腎癌的潛在預后生物標志物。

2.2 去甲基轉移酶與RCC的關系研究表明ALKBH1[29]和ALKBH5[30]在RCC組織中,FTO和ALKBH5在ccRCC組織[31]中的表達上調。ALKBH1表達量與RCC的惡性特征相關[29];ALKBH5高表達組患者的腫瘤更大、TNM分期更高、預后更差[30];FTO和ALKBH5的表達水平與RCC患者預后相關[31],敲低FTO和ALKBH5可抑制ccRCC細胞中的上皮-間質轉化和細胞周期進展,促進RCC細胞的遷移和增殖。

2.3 閱讀蛋白與RCC的關系m6A閱讀蛋白YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和IGF2BPs等在RCC組織和正常腎組織間存在差異表達[32]。Ying et al[33]發現,IGF2BPs在RCC中高表達,且IGF2BPs表達量越高患者預后越差。Li et al[34]發現,YTHDC1在ccRCC中表達下調,表達量越低的ccRCC患者預后越差,且YTHDC1過表達可抑制ccRCC在體內外的增殖、侵襲和轉移,表明YTHDC1在ccRCC中發揮抑癌作用。研究[25]顯示,METTL14通過募集閱讀蛋白YTHDF2,抑制促癌基因表達從而抑制RCC的生長和轉移。

3 m6A甲基化在RCC中的作用機制

m6A甲基化的調控因子可通過調控原癌基因表達、調節細胞代謝、調節腫瘤免疫多種機制在RCC中起到促癌或抑癌作用。

3.1 調控原癌基因表達METTL3可通過促進原癌基因人HERV-HLTR關聯蛋白2(human HERV-HLTR-associating protein 2,HHLA2)的mRNA穩定性,上調HHLA2表達從而促進癌細胞增殖和遷移[35]。ALKBH1通過促進原癌基因G蛋白偶聯受體137[29]和極光激酶B(aurora kinase B,AURKB)[30]的mRNA穩定性并上調其表達,上調的AURKB蛋白能夠促進RCC細胞在體內外的增殖。WTAP通過直接結合周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinases 1,CDK1)的轉錄物,增強其mRNA穩定性,上調CDK2表達[24],CDK2的異常表達可使細胞越過G1/S極限,縮短細胞周期,促進細胞惡性增殖。Ying et al[33]揭示了WTAP通過促進致癌基因鞘氨醇1磷酸酯受體3(recombinant sphingosine 1 phosphate receptor 3,S1PR3)mRNA的穩定性,激活PI3K/AKT通路從而促進RCC細胞的增殖和遷移。

Gong et al[36]研究發現,METTL14可通過介導P2RX6的前體mRNA剪切,下調其表達從而抑制RCC發展。METTL14依賴于YTHDF2的RNA降解作用,加速核富集轉錄本1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)[25]和整合素β4(integrin beta 4,ITGB4)[37]的mRNA降解,下調原癌基因表達從而抑制RCC細胞增殖和遷移。類似地,Li et al[34]的研究結果顯示,敲低YTHDC1可增加原癌基因膜聯蛋白A1(annexin A1,ANXA1)的mRNA穩定性,而過表達的YTHDC1通過下調ANXA1表達,抑制MAPK信號通路的激活,從而抑制ccRCC進展。

3.2 調節細胞代謝Shim et al[38]研究發現,癌細胞代謝產物右旋羥戊二酸(R-2-hydroxyglutarate,R-2HG)在ccRCC細胞中高濃度累積,可與包括FTO和ALKBH5在內的多種m6A修飾酶的活性位點結合[39],提示m6A甲基化修飾與細胞代謝之間存在聯系。Shi et al[23]發現METTL3可通過ATP結合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉運蛋白D1(ABCD1)調節細胞代謝促進RCC進展,METTL3選擇性靶向ABCD1,提高β氧化和線粒體功能從而促進腎細胞癌腫瘤球體形成和細胞遷移。VHL基因(von hippel-Lindau)缺乏或突變是ccRCC的常見特征[40],VHL失活導致缺氧誘導因子(HIFs)激活,這對ccRCC的細胞代謝重編程具有重要價值,而代謝重編碼可促進腎癌細胞迅速增殖[41]。Xiao et al[42]發現,VHL缺失或突變的ccRCC腫瘤中FTO表達增加,FTO通過促進溶質載體家族1成員5(solute carrier 1 family member 5,SLC1A5)表達,促進VHL缺陷型ccRCC細胞的代謝重編程和存活。Ying et al[33]揭示IGF2BP1通過直接結合乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA),促進LDHA的mRNA穩定性上調其表達,促進ccRCC的有氧糖酵解過程從而促進癌細胞增殖。Zhang et al[27]研究發現,敲除METTL14可上調溴區結構域轉錄因子(bromodomain PHD-finger transcription factor, BPTF)蛋白的表達,BPTF可通過糖酵解重編碼和代謝重塑,顯著提高RCC細胞糖酵解活性和遷移能力和RCC細胞的遷移速度。

3.3 調節腫瘤免疫Wei et al[21]揭示了METTL5在腎癌免疫調節中的作用。METTL5的表達與包括NKT細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞和巨噬細胞在內的多種免疫細胞的浸潤率呈負相關,惡性腫瘤中浸潤的CD8+T細胞和CD4+T細胞可抑制腫瘤[43]。并且,METTL5對高免疫浸潤和低免疫浸潤患者的生存期有不同影響,表明METTL5可能通過調節多種免疫細胞浸潤,在RCC中發揮致癌作用。相反,Jiang et al[26]研究發現,METTL24與免疫細胞的表達呈正相關,同時,METTL24的表達對不同免疫浸潤水平的ccRCC患者的總生存率影響不同,提示METTL24可能通過調節免疫微環境發揮抑癌作用。

4 m6A甲基化修飾相關調控因子抑制劑的臨床應用

目前,以手術和放化療為主的綜合方案是治療RCC的主要手段,但患者復發和轉移率較高,預后較差。基于m6A甲基化修飾與腫瘤的密切聯系,從分子層面研究RCC的發生發展,有利于尋找有效治療靶點,探索新的治療策略。多種m6A甲基化修飾調控因子能夠促進RCC的發生發展,因此靶向抑制這類因子可能為RCC的治療提供新思路。

劍橋大學Tony Kouzarides[44]的研究團隊使用METTL3特異性小分子抑制劑抑制其活性,在體外抑制急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)癌細胞的生長和增殖,抑制小鼠體內癌細胞的增殖并延長了小鼠壽命。同樣,過表達的METTL3也會促進RCC進展[20],因此,靶向抑制METTL3的藥物或許能夠提高RCC患者的生存率。目前,多種FTO抑制劑的抑瘤作用已被證明,FTO抑制劑MA2能有效抑制膠質母細胞瘤的發生[45], FTO選擇性抑制劑MO-I-500能顯著抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖和存活[46],FTO抑制劑或能為RCC的治療帶來新方法。前期研究顯示[47],用METTL3抑制劑Cpd-564可預防腎損傷和炎癥。因此,m6A相關調控因子可成為RCC靶向治療研究中的重要方向。雖然這些抑制劑在人體中的安全性和有效性仍缺乏有效證據,但為提高RCC患者生活質量、延長壽命提供了希望。由于METTL5[21]、WTAP和IGF2BP1[33]在RCC中發揮致癌作用,特異性抑制其活性或許是RCC治療的新思路。

5 總結與展望

現有研究結果表明,多種m6A甲基化修飾相關的調控因子在RCC中扮演重要角色。比如,m6A甲基轉移酶METTL3、METTL5和WTAP在RCC中發揮原癌基因的作用,METTL14抑制腎癌細胞在體內外的增殖和遷移;去甲基轉移酶ALKBH1、ALKBH5和FTO促進RCC進展;YTHDF2及IGF2BPs在內的多種閱讀蛋白與RCC的發生發展及不良預后相關。本文綜述了m6A修飾相關酶在RCC發生發展中的作用和機制,目前研究顯示,m6A甲基化修飾通過調控下游靶標基因的表達發揮作用,或進一步調控相關信號通路影響腫瘤細胞的增殖和遷移,或調控腫瘤能量代謝影響腫瘤細胞的惡性增殖,或通過免疫調節在RCC中發揮作用。然而,m6A甲基化修飾在RCC中的作用機制仍存在其他可能,未來需要通過更多的機制性研究來證明。

目前多項研究發現m6A甲基化修飾相關調控因子抑制劑能夠抑制AML、膠質母細胞瘤、三陰性乳腺癌細胞等多種癌細胞的增殖。然而,迄今為止,尚無針對m6A調控因子的靶向小分子抑制劑和抗體藥物成功應用于臨床。基于m6A甲基化修飾在RCC發生發展過程中的重要作用,其相關的調控因子可成為RCC疾病治療的潛在重要靶點。目前,急需開發有效的治療藥物,為RCC的治療提供新的思路和方法。