低氧條件下SIRT3調(diào)控ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響

黃 波,丁 潔,郭紅榮,王紅娟,徐建群,鄭 泉

肺癌是全球最常見(jiàn)的癌癥之一,發(fā)病率和病死率高[1]。低氧是腫瘤快速生長(zhǎng)中過(guò)量氧消耗和血管供應(yīng)不足所導(dǎo)致的重要腫瘤微環(huán)境特征[2]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的表達(dá)是低氧的標(biāo)志,HIF-1α可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的血管生成和細(xì)胞周期進(jìn)程等促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3]。去乙酰化酶3(sirtuin 3, SIRT3)被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)組織中高表達(dá),與NSCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。有文獻(xiàn)[5]報(bào)道SIRT3可通過(guò)抑制線(xiàn)粒體活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成抑制HIF-1α和腫瘤生長(zhǎng),但在低氧條件下SIRT3是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)ROS的生成從而影響肺癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和HIF-1α表達(dá),目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,該研究旨在探討低氧條件下SIRT3通過(guò)ROS對(duì)肺癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)和HIF-1α表達(dá)的影響及其機(jī)制,為肺癌的靶向治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。ROS抑制劑N-乙酰半胱胺酸(n-acetylcysteine, NAC)(貨號(hào):HY-B0215)購(gòu)于美國(guó)MCE公司,F12K培養(yǎng)基(貨號(hào):21127-022)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司,BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、MTT(貨號(hào):PC0020、R0010、M1025)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司,一抗SIRT3、HIF-1α、GAPDH和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào):PAB35180、PAB37598、PAB36269、SAB43714)購(gòu)于武漢貝茵萊生物科技有限公司,SYBR FAST qPCR Master Mix(貨號(hào):KM4101)購(gòu)于美國(guó)KAPA Biosystems公司,TRIzol(貨號(hào):15596026)購(gòu)于美國(guó)ambion公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):6210A)購(gòu)于日本TAKARA公司,DMSO(貨號(hào):D2650)購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司,AnnexinV-PE/7 AAD凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):559763)購(gòu)于美國(guó)BD公司,ROS檢測(cè)試劑盒(含ROS熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)(貨號(hào):S0033)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(super oxide dimutese, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A003-1-2、A001-3-2、A006-2-1)購(gòu)于南京建成生物工程研究所。311型CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,AMR-100酶標(biāo)儀購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司,NovoCyte流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)ACEA公司,CFX-Connect 96熒光定量PCR儀、mini protean 3 cell電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及低氧細(xì)胞模型的構(gòu)建 A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí),胰酶消化細(xì)胞,按1 ∶2的比例傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6孔板中,5×105個(gè)細(xì)胞/孔,每孔2 ml,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞暴露于低氧(5%～8%O2)條件下培養(yǎng)0、12、24、48 h,RT-PCR和Western blot檢測(cè)低氧條件下不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞中HIF-1α和SIRT3 mRNA和蛋白的表達(dá),由此確定最佳低氧誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.2構(gòu)建SIRT3過(guò)表達(dá)慢病毒載體和穩(wěn)轉(zhuǎn)株 根據(jù)SIRT3的序列構(gòu)建過(guò)表達(dá)慢病毒載體,轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中,并篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株,以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞為對(duì)照,RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中SIRT3 mRNA的表達(dá),驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,顯示慢病毒轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功。

1.2.3細(xì)胞分組及處理 將A549細(xì)胞分成5組:對(duì)照組、低氧組、低氧+ROS抑制劑NAC組、低氧+SIRT3過(guò)表達(dá)(SIRT3 overexpression, SIRT3-OE)組和低氧+SIRT3-OE+NAC組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng);低氧組細(xì)胞暴露于低氧條件下培養(yǎng)24 h;低氧+NAC組先用20 mmol/L的NAC誘導(dǎo)24 h[6],再暴露于低氧條件下培養(yǎng)24 h;低氧+SIRT3-OE組將SIRT3過(guò)表達(dá)慢病毒細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株在低氧條件下培養(yǎng)24 h;低氧+SIRT3-OE+NAC組將SIRT3過(guò)表達(dá)慢病毒細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株用20 mmol/L的NAC誘導(dǎo)24 h,于低氧條件下培養(yǎng)24 h。處理完成后,取出細(xì)胞培養(yǎng)板,加入MTT溶液,培養(yǎng)4 h后吸去上清液,加入DMSO溶解液,搖床低速振蕩10 min,結(jié)晶物充分溶解后酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度值,以檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞,加入預(yù)冷的PBS洗滌,PBS重懸細(xì)胞,加入10 μl Annexin V-FITC和7 AAD,混勻,4 ℃避光孵育30 min,加入PBS,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5RT-PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α和SIRT3 mRNA和蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞,TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列表見(jiàn)表1。以GAPDH為內(nèi)參,2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。提取細(xì)胞總蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,上樣電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,加入一抗稀釋液(1 ∶1 000)室溫孵育1 h,洗膜3次,加入二抗稀釋液(1 ∶20 000)室溫孵育1 h,洗膜3次,ECL顯影,TANON GIS軟件讀取條帶灰度值,目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列表

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmol/L。收集1.2.3項(xiàng)各組細(xì)胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育20 min,待DCFH-DA和細(xì)胞充分接觸后用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞,PBS重懸,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7生化試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中MDA、SOD和GSH的含量 收集1.2.3項(xiàng)各組細(xì)胞上清液,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)MDA、SOD和GSH的含量。

2 結(jié)果

2.1 低氧暴露不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞中HIF-1α和SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響與0 h相比,低氧暴露12 h細(xì)胞中HIF-1α mRNA水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.78,P>0.05),HIF-1α蛋白水平升高(t=-5.36,P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白水平均降低(tmRNA=-6.38,t蛋白=5.81, 均P<0.01);低氧暴露24 h和48 h細(xì)胞中HIF-1α mRNA和蛋白水平均升高(tmRNA(24 h)=-6.92,tmRNA(48 h)=-12.47,t蛋白(24 h)=-7.51,t蛋白(48 h)=-11.11, 均P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白水平均降低(tmRNA(24 h)=10.95,tmRNA(48 h)=13.76,t蛋白(24 h)=11.95,t蛋白(48 h)=17.63, 均P<0.01)。見(jiàn)圖1。因此最終確定最佳低氧誘導(dǎo)時(shí)間為24 h。

圖1 低氧暴露不同時(shí)間細(xì)胞中HIF-1α和SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

2.2 低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組(0.90±0.02)相比,低氧組(1.26±0.02)細(xì)胞增殖能力升高(t=-16.28,P<0.01);與低氧組比較,低氧+NAC組(0.88±0.03)和低氧+SIRT3-OE組(0.97±0.01)細(xì)胞增殖能力均降低(t低氧+NAC組=16.92,t低氧+SIRT3-OE組=13.21, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組(0.74±0.04)細(xì)胞增殖能力降低(t=6.46,P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞增殖能力的比較

2.3 低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組(8.59%±0.51%)相比,低氧組(3.98%±0.33%)細(xì)胞凋亡率降低(t=3.45,P<0.05);與低氧組比較,低氧+NAC組(15.50%±1.04%)和低氧+SIRT3-OE組(16.55%±0.43%)細(xì)胞凋亡率均升高(t低氧+NAC組=-8.62,t低氧+SIRT3-OE組=-9.41, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組(25.90%±3.43%)細(xì)胞凋亡率升高(t=-7.78,P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

2.4 低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3對(duì)A549細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,低氧組細(xì)胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(tmRNA=-14.32,t蛋白=-20.21, 均P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(tmRNA=22.89,t蛋白=16.41, 均P<0.01);與低氧組相比,低氧+NAC組和低氧+SIRT3-OE組細(xì)胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(tmRNA(低氧+NAC組)=-7.21,tmRNA(低氧+SIRT3-OE組)=8.44,t蛋白(低氧+NAC組)=5.60,t蛋白(低氧+SIRT3-OE組)=9.00, 均P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(tmRNA(低氧+NAC組)=-4.49,tmRNA(低氧+SIRT3-OE組)=-5.34,t蛋白(低氧+NAC組)=-6.21,t蛋白(低氧+SIRT3-OE組)=-9.08, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組細(xì)胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(tmRNA=5.70,t蛋白=7.65, 均P<0.01),SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(tmRNA=-8.20,t蛋白=-8.57, 均P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞中HIF-1α和SIRT3的mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

2.5 低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3對(duì)A549細(xì)胞中ROS含量的影響與對(duì)照組(5.80%±1.85%)相比,低氧組(47.43%±4.01%)細(xì)胞中ROS含量升高(t=-18.67,P<0.01);與低氧組相比,低氧+NAC組(35.77%±2.58%)和低氧+SIRT3-OE組(29.67%±1.57%)細(xì)胞中ROS含量均降低(t低氧+NAC組=5.23,t低氧+SIRT3-OE組=7.96, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組(19.80%±2.95%)細(xì)胞中ROS含量降低(t=7.16,P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞中ROS含量的比較

2.6 低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3對(duì)A549細(xì)胞中MDA、SOD和GSH含量的影響與對(duì)照組相比,低氧組細(xì)胞中MDA含量升高(t=-18.44,P<0.01),SOD和GSH含量降低(tSOD=14.79,tGSH=20.94, 均P<0.01);與低氧組相比,低氧+NAC組和低氧+SIRT3-OE組細(xì)胞中MDA含量降低(t低氧+NAC組=7.62,t低氧+SIRT3-OE組=11.74, 均P<0.01),SOD(t低氧+NAC組=-6.44,t低氧+SIRT3-OE組=-8.65, 均P<0.01)和GSH含量升高(t低氧+NAC組=-7.19,t低氧+SIRT3-OE組=-12.76, 均P<0.01);與低氧+NAC組相比,低氧+SIRT3-OE+NAC組細(xì)胞中MDA含量降低(t=9.37,P<0.01),SOD和GSH含量升高(tSOD=-5.80,tGSH=-10.14, 均P<0.01)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組細(xì)胞中MDA、SOD和GSH含量的比較

3 討論

研究[7]表明,SIRT3在NSCLC中具有抑癌作用。本研究結(jié)果顯示,低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,并抑制腫瘤細(xì)胞增殖,提示SIRT3具有腫瘤抑制作用,與前人研究結(jié)果一致[7-8]。腫瘤微環(huán)境在維持NSCLC的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管、可溶性因子和低氧狀態(tài)等構(gòu)成了NSCLC中的腫瘤微環(huán)境,其中低氧是肺癌腫瘤最常見(jiàn)的微環(huán)境特征,能夠影響癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和代謝[2]。腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)主要受HIF的調(diào)節(jié),HIF可隨著細(xì)胞氧水平的降低而增加[9]。低氧時(shí)HIF-1α水平的升高,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝,誘導(dǎo)存活分子的產(chǎn)生、促進(jìn)新生血管的形成,使腫瘤細(xì)胞在低氧條件下存活和轉(zhuǎn)移,從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。研究[10]表明,HIF-1α的表達(dá)受SIRT3介導(dǎo)的去乙酰化調(diào)控。本研究結(jié)果顯示,低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3能夠抑制HIF-1α的表達(dá),與前期研究[11]結(jié)果一致,提示低氧條件下SIRT3能夠通過(guò)抑制HIF-1α的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤進(jìn)展。

研究[12]發(fā)現(xiàn),SIRT3在調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體功能和ROS產(chǎn)生中也發(fā)揮重要作用。ROS是一種非常重要的生物活性物質(zhì),可通過(guò)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化或破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸誘導(dǎo)細(xì)胞壞死或凋亡,被認(rèn)為是治療癌癥的重要藥物[13]。在癌細(xì)胞中,ROS信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞的存活、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯以及腫瘤的形成和發(fā)展中起著重要作用。高水平的ROS有助于癌細(xì)胞增殖、DNA改變、凋亡、轉(zhuǎn)移和血管生成[14]。本研究結(jié)果顯示,低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3能夠抑制ROS的增加,表明SIRT3對(duì)ROS具有抑制作用。此外還檢測(cè)了低氧條件下過(guò)表達(dá)SIRT3對(duì)A549細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA、SOD和GSH的影響,其中MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化氫的最終產(chǎn)物,是ROS的指示物;SOD是一種將O2-催化還原為過(guò)氧化氫的酶;GSH可以催化過(guò)氧化氫和其他過(guò)氧化物的還原,具有抗氧化作用[15]。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)SIRT3能夠降低MDA水平,升高SOD和GSH水平。為明確低氧條件下SIRT3調(diào)控ROS的機(jī)制,用ROS抑制劑NAC處理A549細(xì)胞,結(jié)果顯示,與NAC單獨(dú)處理相比,NAC聯(lián)合過(guò)表達(dá)SIRT3后細(xì)胞ROS水平降低,MDA水平降低,SOD和GSH水平升高,表明SIRT3能夠通過(guò)抑制ROS來(lái)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),NAC聯(lián)合過(guò)表達(dá)SIRT3細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡率升高。