基于核酸適配體-磁珠的豬血IgG提取方法研究①

郭 嬡,王倩鈺,凡思華,王文強,黃柳燕,張 強,王景濤

(1. 佳木斯大學公共衛生學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.廣東石油化工學院生物與食品工程學院,廣東 茂名 525000)

我國每年出欄和屠宰豬的數量巨大。據國家統計局公布,2022年全國生豬出欄量約69995萬頭,屠宰量約為28538萬頭。根據實際情況,每頭豬可生產約2.2公斤豬血,那么2022年中國豬血產量達到了62785噸[1]。目前我國豬血開發產品還比較單一。長期以來,由于人們對動物血液產品的特殊保健作用缺乏了解,血液產品加工技術落后,一般僅采用最原始熱處理被加工成血粉,不僅破壞了一些蛋白質的功能特性,還導致產品的營養質量低、利用率低,而且極不衛生[2]。

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是僅次于白蛋白的血液中第二豐富的蛋白質。根據Ig理化性質尤其是免疫學性質,可分為五類,即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在血漿蛋白中含量最高的Ig類型是IgG,約占總Ig的75%[3]。IgG補充劑具有提高免疫力,預防感冒和腹瀉的功效;對于嬰幼兒及青少年還可以促進生長發育,預防齲齒;對于體弱者和病人還能夠促進身體恢復,預防繼發疾病發生[4]。

目前,有關IgG提取和純化方法中,冷乙醇沉淀是最常采用的方法。該方法使用不同濃度的乙醇,在低溫下進行多步離心,達到初步提取IgG的目的。與傳統的柱色譜法相比,冷乙醇沉淀法具有易于放大和操作相對簡單的優點。然而,此方法也有一些不可忽視的缺點。例如,多步離心分級十分耗時,且易導致IgG損失,使用有機溶劑不僅影響IgG活性還會引起環境凈化問題[5]。此外,現有的IgG提取方法如鹽析法、辛酸沉淀法、層析法、低溫乙醇法等[6, 7],均不同程度地存在回收率低、純度低、成本高以及環境污染等不足[8]。隨著人們對IgG功能的認識不斷深化,市場對IgG相關產品的需求不斷增長,對其質量的要求也越來越高。因此,研究和開發一種新型高效的IgG提取方法勢在必行。

核酸適配體是通過指數富集配體系統進化(SELEX)技術,從合成的隨機寡核苷酸序列庫中,反復篩選得到的能與靶分子特異結合的一段寡核苷酸序列[9]。將核酸適配體應用于IgG提取具有突出的應用優勢,如易合成、純度高、特異性結合IgG、穩定好、易修飾標記等[10, 11]。基于以上核酸適配體的自身特性,結合磁珠在分離提取中具有的快速簡便優勢,本研究開展了豬血IgG核酸適配體-磁珠提取方法探索,以期為我國豬血資源化利用以及醫藥衛生產品開發提供新的技術。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TGL-20M臺式高速冷凍離心機(上海盧相依實驗室儀器有限公司);101-3AB電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);THZ-92B氣浴恒溫振蕩器(常州金壇精達儀器制造有限公司);JP-O7O5超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設備有限公司);SC083276分析型超純飲水機(四川沃特爾水處理設備有限公司);AE223電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);WIX-EP300迷你垂直電泳儀(韋克斯科技有限公司);DR-3000酶標分析儀(無錫華衛德朗儀器有限公司);PHS-3C酸度計(杭州奧立龍儀器有限公司);HJ-2A數顯恒溫多頭磁力攪拌器(常州亞特實驗儀器有限公司);磁力架(廣州齊云生物科技有限公司);四維旋轉混合儀(北京中科科儀股份有限公司)。

羧基化磁珠(粒徑為100-200 nm,濃度為10 mg/mL,江蘇先豐納米材料科技有限公司);末端氨基修飾的IgG核酸適配體(序列為5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCCACTCA-C6-NH2,由生工生物工程上海股份有限公司合成);豬IgG酶聯免疫分析試劑盒(上海烜雅生物科技有限公司);透析袋、檸檬酸三鈉、氯化鈉、氯化鈣、EDTA、碳酸氫鈉、Tween-20、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、MES緩沖液(0.2 mol/L,pH6.0)均為分析純,均由上海畢得醫藥科技股份有限公司提供。

新鮮豬血取自茂名市茂南區高山食品公司城東屠宰場,按照9:1的比例加入了3.8% 的檸檬酸三鈉溶液作為抗凝劑。在4 ℃條件下,3000 r/min離心30min分離血細胞和血漿。將分裝于離心管中,于-20 ℃冰箱儲存備用。

1.2 方法

1.2.1 磁珠與核酸適配體偶聯

取100μL羧基磁珠懸浮液于5mL離心管中,加入2mL的MES緩沖液,輕微振搖3min清洗磁珠,然后磁分離,如此重復清洗3次。然后依次加入2mL的EDC(5mg/mL,MES溶解)和NHS(5mg/mL,MES溶解)溶液,混合均勻,室溫下振搖30min,然后磁分離,此時磁珠表面的羧基已經活化。活化的羧基磁珠分別與末端氨基修飾IgG核酸適配核酸適配體進行偶聯。用2mL的MES溶液將活化后的羧基磁珠洗滌兩次,加入10μL的末端氨基修飾的核酸適配體(100μmol/L),室溫振搖孵化1h,孵化結束后用2mL的PBST(0.01mol/L,1% Tween-20)緩沖液清洗3次。最后將洗滌后的磁珠-末端氨基修飾核酸適配體重懸于100μL的PBST儲備液中,4 ℃保存,用于后續實驗。

1.2.2 IgG提取條件優化

取血漿10mL,按血漿/磁珠體積比150:1、125:1、100:1、75:1、50:1加入磁珠,4℃條件下置于四維旋轉混合儀上孵育,時間為0.5、1.0、2.0、4.0、6h。孵育結束后,至于磁力架分離磁珠,采用不同濃度NaCl(1.0、1.5、2.0、2.5mol/L)的PBS洗脫液洗脫IgG,獲得IgG提取物。

1.2.3 透析

將透析袋剪成合適的小段,放在2%的碳酸氫鈉和1mol/L的EDTA(pH=8)中將透析袋煮沸10min,然后用蒸餾水徹底清洗透析袋。再將清洗后的透析袋放在1mol/L的EDTA(pH=8)中煮沸10min,冷卻后,將透析袋浸沒在30%的乙醇中,每次使用透析袋之前,用蒸餾水將其清洗干凈即可。用EP管和透析袋自制一個小型的透析管,將凝血酶原、IgG和SOD溶液轉移到透析管中,在4℃條件下對蒸餾水進行透析,期間更換3～4次透析液,用1% AgNO3檢驗,直至Cl-離子透析完為止。得到干凈的凝血酶原、免疫球蛋白和SOD溶液。凝血酶原溶液需要激活,IgG和SOD溶液可直接進行相應的檢測。

1.2.4 IgG含量測定

采用豬IgG酶聯免疫分析試劑盒,按照廠家說明書操作方法,測定提取IgG的含量及收率,收率計算公式如下:

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 IgG提取單因素分析

2.1.1 血漿與核酸適配體-磁珠混合的體積比

通過ELISA測定分析,血漿與核酸適配體-磁珠混合的體積比對IgG提取效果具有較大影響。核酸適配體-磁珠在血漿中占比增加時,IgG提取量持續增加,當血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1時,IgG提取量達到最大。但是,繼續加大核酸適配體-磁珠占比,反而使IgG提取量降低。SDS-PAGE電泳實驗結果顯示了與ELISA分析一致的結果,如圖1A。血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1時,IgG提取蛋白條帶相對最為明顯。提取蛋白與IgG標準品輕鏈(相對分子質量約20 Kd)和重鏈(相對分子質量約45 Kd)相一致,如圖1B。

A: ELISA分析結果;B:SDS-PAGE分析結果。M:蛋白marker;1:IgG標準品;2-6:分別對應血漿與核酸適配體-磁珠混合體積比為150:1、125:1、100:1、75:1、50:1。

2.1.2 血漿與核酸適配體-磁珠孵育時間

ELISA測定結果顯示,在血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1情況下,血漿與核酸適配體-磁珠孵育時間對IgG提取量具有影響,當孵育時間在0.5～2.0h之間時,IgG提取量隨孵育時間延長而增加,繼續延長孵育時間不會增加IgG提取量,表明孵育2.0h可使核酸適配體-磁珠結合IgG達到飽和狀態,如圖2A。SDS-PAGE電泳實驗結果顯示了與ELISA分析一致的結果。與孵育0.5h和1.0h

A: ELISA分析結果;B:SDS-PAGE分析結果。M:蛋白marker;1:IgG標準品;2～6:分別對應血漿與核酸適配體-磁珠孵育時間為0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h。

相比,血漿與核酸適配體-磁珠孵育2.0h時,IgG蛋白條帶更為明顯,但孵育4.0h和6.0h,IgG蛋白條帶沒有加深趨勢,如圖2B。

2.1.3 洗脫液NaCl濃度

ELISA測定結果顯示,在血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1,時間為2.0h情況下,洗脫液(PBS)NaCl濃度對IgG提取量具有影響,當洗脫液中NaCl濃度為1.5mol/L時,核酸適配體-磁珠上的IgG洗脫最為充分,繼續加大NaCl濃度對不會增加IgG提取量,反而產生不利影響,如圖3A。SDS-PAGE電泳實驗結果顯示了與ELISA分析一致的結果。與其他NaCl濃度相比,洗脫液中NaCl濃度為1.5mol/L時,IgG蛋白條帶更為明顯,如圖3B。

A: ELISA分析結果;B:SDS-PAGE分析結果。M:蛋白marker;1:IgG標準品;2～6:分別對應洗脫液NaCl濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L。

2.2 IgG提取的正交試驗結果

根據單因素試驗結果,設計 L9(34)型正交試驗,研究血漿與核酸適配體-磁珠混合體積比、孵育時間、洗脫液NaCl濃度共同作用下,IgG提取的最優條件,見表1。

表1 IgG提取試驗因素水平表

影響豬血IgG含量因素的主次順序為:C>A>B,即血漿與核酸適配體-磁珠孵育時間對IgG含量影響最顯著,其次是混合體積比。最優組合為A2B2C3,即以豬血為原料提取IgG的最優條件為:反應體積比為100:1,孵育時間2.0h,洗脫液NaCl濃度1.5mol/L。此結果與單因素分析結果高度一致。在此最優條件下,IgG收率為91%,見表2。

表2 IgG提取正交試驗結果

3 討論

核酸適配體-磁珠在血漿中的占比,一方面影響到IgG的提取效率,另一方面也決定了提取成本,因此這一提取因素十分重要。本研究相關結果表明,當血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1時,IgG提取量達到最大。核酸適配體-磁珠在血漿中占比低時,血漿中IgG過量,核酸適配體-磁珠不能充分結合IgG,導致提取率較低。但是,如果核酸適配體-磁珠在血漿中占比過高時,血漿IgG分配到核酸適配體-磁珠上的比例將會下降,在后續洗脫過程中,由于洗脫率不可能達到100%,因此導致IgG提取效率降低。血漿與核酸適配體-磁珠孵育時間決定了提取方法快速性,同時對保證IgG的生物活性起到至關重要的作用。本研究相關結果表明,當孵育時間在2.0h時,IgG提取效率達到最佳,繼續延長孵育時間不會增加IgG提取量,原因是核酸適配體-磁珠與IgG結合達到飽和狀態時,提取率將不會增加。核酸適配體與IgG以非共價方式結合,NaCl濃度洗脫液決定了洗脫液的離子強度,在高離子強度下,IgG將與核酸適配體-磁珠分離。本研究相關結果表明,當洗脫液中NaCl濃度為1.5mol/L時,核酸適配體-磁珠上的IgG洗脫最為充分,繼續加大NaCl濃度對不會增加IgG提取量,反而產生不利影響,其原因主要是在IgG已經充分解離的情況下,進一步加大洗脫液中的離子強度可能導致IgG分子中Fc片段結構改變或破壞,而ELISA檢測主要識別的是IgG分子中的Fc片段,導致測定結果顯著下降。正交分析結果表明,在血漿與核酸適配體-磁珠混合體積比、孵育時間、洗脫液NaCl濃度共同作用下,影響豬血IgG含量因素的主次順序為:血漿與核酸適配體-磁珠孵育時間>混合體積比>洗脫液NaCl濃度,IgG的最優提取條件為:反應體積比為100:1,孵育時間2.0h,洗脫液NaCl濃度1.5mol/L。此結果與單因素分析結果高度一致,表明單因素分析的結果比較可靠。

綜上所述,本研究建立了基于核酸適配體-磁珠的豬血IgG提取方法,該方法具有快速、收率高、條件溫和、不使用有機溶劑等優點,在豬血資源化利用以及醫藥衛生產品開發方面展現出良好的應用前景。