新疆黑枸杞原花青素的提取及抗氧化活性研究

張榮，古麗吉合熱·阿布拉

新疆第二醫學院（克拉瑪依 834000）

黑枸杞（Lycium ruthenicum）是枸杞屬（Lycium）茄科（Solanceae）的多年灌木野生荒漠植物，果實成熟呈近卵球形，為藍紫色，有淡淡的甜味，屬平性藥物，能夠清熱解毒，擁有非常良好的藥用價值和食用價值[1]。黑枸杞主要在月經不調、增強免疫功能、延緩肌體衰老等方面有顯著作用[2]。黑枸杞果實含有多糖、總黃酮、蛋白質等[3-4]多種天然活性的營養成分，其中原花青素的含量遠高于其他天然植物，是最有效的天然抗氧化劑[5-9]。黑枸杞作為提取原花青素的理想植物，具有廣闊的應用空間[10]。

20世紀50年代，法國科學家Jacque Masqulier首次從松樹皮中提取原花青素，之后原花青素被發現更多來源，并得到廣泛的研究和利用[11]。原花青素作為天然強有效的自由基清除劑，能有效清除OH-，O2-、NO-、DPPH等多種自由基，具有舒張血管、降糖、降血脂[12-16]、抑制腎功能和腸功能障礙、提高記憶力、抗肥胖、美白等保健食療作用[17-20]。原花青素分子結構中含有不對稱的碳原子，具有旋光性；分子帶有多個酚羥基，極性較強，易溶于水、乙醇、甲醇等，不溶于乙醚、氯仿、苯等有機溶劑；分子中存在苯環結構，在紫外光區吸收較強[21-22]。

原花青素具有很好的藥理作用，獲得原花青素的提取工藝就顯得尤為重要。故試驗探究黑枸杞原花青素最優提取工藝，并分別考察黑枸杞原花青素提取物對DPPH自由基清除作用、OH-自由基清除作用、總還原能力，以期為黑枸杞原花青素進一步研究奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標準品（98%，北京索萊寶科技有限公司）；NaOH（分析純，天津市北聯精細化學試劑有限公司）；NaNO2、硝酸鋁（分析純，天津市盛奧化學試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市鑫鉑特化工有限公司）；蒸餾水（實驗室自制）；黑枸杞（新疆阿克蘇）；DPPH（分析純，Solarbio）；磷酸鹽緩沖溶液（分析純，Biosharp）；鐵氰化鉀（分析純，天津市北聯精細化學試劑有限公司）；三氯乙酸（分析純，上海山蒲化工有限公司）；FeCl3、30%過氧化氫（分析純，天津市北聯精細化學試劑有限公司）；FeSO4（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；水楊酸（分析純，天津市北聯精細化學試劑有限公司）；抗壞血酸（分析純，天津市天新精細化工有限公司）。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（UV1801G，天津冠澤科技有限公司）；電子天平（YP202N，上海菁海儀器有限公司）；超聲儀（KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 研究方法

1.3.1 原花青素含量的測定

1.3.1.1 蘆丁標準品溶液的配制

精確稱取5 mg干燥至恒重的蘆丁標準品于燒杯，加入少量的無水乙醇溶解，加入蒸餾水定容至25 mL容量瓶中，搖勻，配成0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

1.3.1.2 原花青素吸收峰確定

取一定量0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液于25 mL容量瓶中，加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉，放置6 min后，加0.4 mL 10%硝酸鋁，放置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉，加蒸餾水至刻度搖勻，放置15 min，得顯色液。配成的顯色液使用紫外可見分光光度計進行全波長掃描，并使之吸光度（A）在0.2～0.8范圍內。確定在510 nm波長處有最大吸收峰。

1.3.1.3 標準曲線的繪制

分別精密吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL標準品溶液于25 mL容量瓶中，依次加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉，0.4 mL 10%硝酸鋁，加各溶液后要放置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，于波長510 nm處測定吸光度，以對照品溶液濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，進行線性回歸，根據文獻[22-23]藍莓花青素的提取工藝并稍作修改。

1.3.2 黑枸杞原花青素的提取

將黑枸杞粉碎，過0.250 mm（60目）篩，稱取2.0 g于圓底燒瓶中，按一定超聲提取時間、提取溫度、乙醇體積分數處理，待提取液冷卻后過濾，將提取液置于容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度后，配成供試品溶液。取1.0 mL按1.3.1.2項下的方法測定吸光度，帶入回歸方程計算原花青素濃度，按照式（1）計算其得率。

1.3.2.1 單因素試驗

1.3.2.1.1 不同提取時間對原花青素得率的影響

稱取5份2.0 g過0.250 mm（60目）篩的黑枸杞粉末，分別置于圓底燒瓶中，使用70%乙醇作為溶劑在提取溫度60 ℃下，用超聲儀測定提取時間15，30，60，90和120 min對黑枸杞原花青素得率的影響。

1.3.2.1.2 不同提取溫度對原花青素得率的影響

稱取5份2.0 g過0.250 mm（60目）篩的黑枸杞粉末，分別置于圓底燒瓶中，使用70%乙醇作為溶劑在提取時間60 min下，用超聲儀測定提取溫度30，40，50，60和70 ℃對黑枸杞原花青素得率的影響。

1.3.2.1.3 不同乙醇體積分數對原花青素得率的影響

稱取5份2.0 g過0.250 mm（60目）的黑枸杞粉末，分別置于圓底燒瓶中，使用70%乙醇作為溶劑在提取時間60 min下，用超聲儀測定乙醇體積分數10%，30%，50%，70%和95%對黑枸杞原花青素得率的影響。

1.3.2.2 正交試驗

通過單因素試驗，篩選出最佳提取時間、提取溫度、乙醇體積分數，并分別選取最佳條件的前后1組條件進行三因素三水平正交試驗。

1.3.3 黑枸杞原花青素的抗氧化活性試驗

1.3.3.1 黑枸杞原花青素對DPPH自由基的清除作用

參考張欣[24]采用DPPH自由基清除率法，精密稱取4.4 mg DPPH，使用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到0.04 mg/mL的DPPH溶液。將黑枸杞原花青素提取物分別配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列濃度。分別取2 mL不同質量濃度的待測液，加2 mL DPPH溶液，在室溫下反應30 min后于波長517 nm處測定吸光度，此處吸光度為A1。取2 mL DPPH溶液和2 mL 70%乙醇在室溫下反應30 min后于波長517 nm處測定吸光度，此處吸光度為A0。分別取2 mL不同質量濃度的待測液，加2 mL 70%乙醇，在室溫下反應30 min后于波長517 nm處測定吸光度，此處吸光度為A2。以維生素C對照品為陽性對照，按式（2）計算清除率。

1.3.3.2 黑枸杞原花青素對OH-自由基的清除作用

參考閆莉莉等[25]采用的OH-自由基清除率法，將黑枸杞原花青素提取物，分別配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列濃度。分別取1 mL不同質量濃度的待測液，加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，在波長510 nm處測定吸光度，此處吸光度為Ax。取1 mL蒸餾水，其中加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL混勻，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，在波長510 nm處測定吸光度，此處吸光度為A0。以維生素C對照品為陽性對照，按式（3）計算清除率。

1.3.3.3 黑枸杞原花青素的總還原能力

將原花青素提取物分別配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列濃度。分別取1 mL不同質量濃度的待測液，加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，在波長510nm處測定吸光度，此處吸光度為Ax。取1 mL蒸餾水，其中加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min，在波長510 nm處測定吸光度，此處吸光度為A0。測定的樣品吸光度越大，表示樣品的總還原能力越強，以維生素C對照品為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=10.742x+0.004 1（R2=0.999 6），在0.008～0.05 mg/mL濃度范圍內具有良好線性關系。

圖1 標準曲線

2.2 黑枸杞原花青素的提取試驗結果

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.11 不同提取時間對原花青素得率的影響

由圖2可知，原花青素得率呈現先上升再下降的變化趨勢。在曲線頂部，即提取時間60 min處有最佳得率，為2.79%。時間大于60 min后，黑枸杞原花青素得率緩慢下降，故單因素試驗選擇提取時間60 min。

圖2 不同提取時間對原花青素得率的影響

2.2.12 不同提取溫度對原花青素得率的影響

由圖3可得知，黑枸杞原花青素得率的曲線趨勢與時間單因素曲線相近，也呈現先上升再徐徐下降趨勢，其原花青素得率2.70%。故單因素試驗選擇提取溫度60 ℃。

圖3 不同提取溫度對原花青素得率的影響

2.2.13 不同乙醇體積分數對原花青素得率的影響

由圖4可知，原花青素得率隨著乙醇體積分數增加而呈現先上升后下降趨勢，在乙醇體積分數為70%時，原花青素最佳得率為2.76%。故單因素試驗提取選擇乙醇體積分數70%。

圖4 不同乙醇體積分數對原花青素得率的影響

2.2.2 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，以原花青素得率為指標，選取時間、提取溫度、乙醇體積分數為自變量，設計L9(33)正交試驗表（表1），結合正交表的條件進行試驗，以確定黑枸杞原花青素的最佳提取工藝。

表1 正交設計因素水平

表2結果能展現黑枸杞原花青素得率的影響因子大小，即提取乙醇體積分數（C）＞提取時間（A）＞溫度（B）。正交表優選的工藝為A2B2C2或A3B2C2，且提取時間和乙醇體積分數對黑枸杞原花青素的提取率影響較為明顯。

表2 正交分布結果表

故綜合所有結果，按照最優工藝A2B2C2，即提取時間60 mim、溫度60 ℃、乙醇體積分數70%，進行驗證試驗，測得原花青素的得率為2.72%，與單因素試驗結果基本一致。

2.3 黑枸杞原花青素的抗氧化活性試驗結果

2.3.1 黑枸杞原花青素對DPPH自由基的清除作用

由圖5可知，黑枸杞原花青素對DPPH自由基的清除率與質量濃度呈正相關，隨著質量濃度不斷增大，清除率隨之增大，且高于相同質量濃度下維生素C的清除率，說明黑枸杞原花青素具有良好的抗氧化能力。

圖5 黑枸杞原花青素對DPPH自由基的清除作用

2.3.2 黑枸杞原花青素對OH-自由基的清除作用

由圖6可知，原花青素清除率隨著質量濃度增加呈現直線上升趨勢，原花青素清除率高于相同質量濃度下維生素C的清除率，表明原花青素是一種有效的自由基清除劑。

圖6 黑枸杞原花青素OH-自由基清除率作用

2.3.3 黑枸杞原花青素的總還原能力測定

由圖7可知，原花青素與維生素C具有明顯差異，并且吸光度呈隨著質量濃度升高而增大趨勢，相同質量濃度下原花青素的總還原能力高于維生素C的，表明原花青素具備較好的總還原能力。

圖7 黑枸杞原花青素總還原能力

3 結論

通過提取工藝優化得出黑枸杞原花青素最佳提取條件：時間60 min、溫度60 ℃、乙醇體積分數70%，原花青素得率為2.72%。原花青素得率受乙醇體積分數的影響最大。黑枸杞原花青素具有對DPPH、OH-自由基的清除作用，具有還原能力，結果表明原花青素的抗氧化能力與質量濃度有關系，而且高于相同質量濃度下維生素C。說明黑枸杞原花青素具有良好的抗氧化能力。試驗結果為黑枸杞原花青素進一步研究奠定基礎，為從黑枸杞中分離抗氧化活性成分和開發天然抗氧化劑提供一定依據，也為進一步深入研究開發和利用新疆黑枸杞資源提供理論參考。