超聲輔助浸提烤肉蘸料中多元素檢測前處理方法

杜華楠，佘鐵軍，楊英嬌，王姣，范雯謖，張蕾

齊齊哈爾市疾病預防控制中心（齊齊哈爾 161000）

烤肉是齊齊哈爾地區特色美食，隨著烤肉文化的影響和商業化推廣，烤肉的受眾群體越來越多，作為烤肉“伴侶”的烤肉蘸料越來越值得重視。烤肉蘸料是結合區域特色食品而生的一種復合調味料，其主料為花生、大豆、芝麻等，其余輔料，不同廠商配比各不相同，烤肉中污染物的限量要求遵循GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》，而GB 31644—2018《食品安全國家標準 復合調味料》中大部分限量要求，特別是元素部分則引用GB 2762—2017，但復合調味品為混合物，很多限值及檢測方法由于其類別歸屬不明確而無法確定，所以針對烤肉蘸料中多元素檢測特點，建立一套實用性強、效率高、穩定性好、針對性強的烤肉蘸料中多元素檢測方法是有必要的。

針對烤肉蘸料等復合調味品的研究主要集中在有機領域對風味物質的檢測和對違規食品添加劑的檢測，對需要精確定量的元素檢測研究較少[1-3]，因重金屬代謝周期長，易沉積在體內，所以對烤肉蘸料中元素的質控更應做到未雨綢繆[4-6]。如：Korkmaz等[7]針對土耳其常見的15種香料中微量元素和鎘含量進行研究；范文秀等[8]通過微波消解法-等離子體發射光譜法對王守義麻辣鮮、燉雞肉香料等10種天然復合調味品中7種金屬元素進行檢測，研究優化消化程序，并對檢測數據進行統計分析。

復合調味料元素檢測前處理方法、檢測方法以及其之間的組合較多，多參照食品中元素檢測的方法，如微波消解、干法消解、火焰原子吸收、石墨爐法等[8-9]，但是烤肉蘸料的特點是原料中主要成分油脂含量較大，對消解條件要求較為苛刻，需要高溫度且長時間消解，如微波消解溫度達200 ℃以上，易造成揮發性元素的損失[10-11]，降低溫度縮短時間會造成消解不完全影響檢測[12]。試驗研究乙醚超聲萃取-微波消解法，通過乙醚超聲浸提處理，去除樣品中大量油脂[13]，對微波消解進行“減負”，最大程度減少揮發性元素損失，保證檢測方法的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烤肉蘸料（齊齊哈爾市售）；金屬多元素混合標準品（美國安捷倫公司）；68%硝酸（優級純，美國Merck牌）；雙氧水（優級純，滬試牌）；無水乙醚（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；純水（實驗室純水機自制）；高純氬氣、高純氦氣（齊齊哈爾市售）。

1.2 儀器與設備

安捷倫7900型電感耦合等離子體質譜儀（ICPMS，美國安捷倫公司）；Mars6型微博消解儀（美國CEM公司）；微型破碎機（德國IKA公司）；BP211D型分析天平（德國賽多利斯公司）；超聲波發生儀；Milli-Q型去離子水發生器（美國Millipore公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理方法

稱取0.5 g市售烤肉蘸料，如樣品粉碎粒度不夠細則需重新粉碎，以免影響消解效果，樣品稱量后編號，待處理。

1.3.2 乙醚超聲浸提方法單因素試驗

以無水乙醚為溶劑，在超聲輔助下對樣品中的油脂進行浸提[14]。

超聲浸提工藝參數的確定[15]：分別對烤肉蘸料中的常量元素Fe、微量元素Pb、易揮發元素Hg這3種元素進行檢測，為增強對比效果，Fe、Pb元素直接檢測，Hg元素含量少易揮發損失進行加標后檢測；分別對超聲浸提的功率、溫度、時間3個主要參數進行單因素試驗，超聲功率單因素區間25～65 W，超聲溫度單因素區間20～60 ℃，超聲時間單因素區間10～50 min，單因素試驗指標設為Q，按式（1）計算。

式中：C0為應用超聲浸提輔助前處理方法檢出元素含量，mg/kg；C1為常規前處理檢出元素含量，mg/kg。

1.3.3 響應面試驗設計

各元素在消解過程中揮發損失的程度不同，應以易損失元素確定消化條件。與其他元素相比，Hg元素更易損失，以Hg元素檢出值為響應值設計中心組合（Box-Behnken）試驗，自變量因素為超聲功率、超聲溫度、超聲時間，Q（Hg）為響應值，自變量水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表

1.3.4 微波消解方法[16-17]

將經過乙醚超聲浸提后的樣品進行除溶劑處理，放入消解罐中，加入8 mL消解液[硝酸與雙氧水（HNO3與H2O2）體積比6︰2]，冷消化1 h，設定2套微波消解程序。第1套微波消解程序為普通方法參數，第2套微波消解程序為配合超聲浸提的微波消解程序。詳見表2。

表2 微波消解條件

1.3.5 金屬元素檢測方法

檢測方法采用ICP-MS法，該方法與傳統的原子熒光、原子吸收檢測法相比，可多元素進行同時檢測，具檢測效率高、靈敏度高、檢出限低等優勢。其中：K、Ca、Na、Mg、Fe等常量元素檢測標準序列范圍為0～10 000 ng/mL；B、Al、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo，Cd、Sn、Sb、Ba、Pb、Li等微量元素檢測標準序列范圍為0～500 ng/mL；Hg元素因其含量低、易殘留等原因需要單獨測定，標準序列范圍為0～3.0 ng/mL；超出曲線部分可進行稀釋后檢測，具體檢測條件見表3。

表3 ICP-MS檢測條件[18-19]

1.3.6 超聲乙醚浸提對微波消解條件的影響[14]

以Hg元素回收率為指標對空白組樣品進行不同濃度梯度的加標回收試驗，詳見表4。

表4 加標回收試驗條件表

1.3.7 確定方法檢出限、定量限[20]

根據單因素試驗及響應面優化法確定試驗參數，對烤肉蘸料中常見的26種元素檢測方法的檢出限、定量限進行計算，按式（2）和（3）計算。

式中：SMDL為檢出限；SLOQ為定量限；σ為空白樣品或被測物定量限界附近的樣品測定值的標準偏差；Sslope為檢出限/定量限附近標準曲線的斜率。

2 結果與分析

2.1 超聲浸提單因素試驗

2.1.1 超聲浸提功率單因素試驗

按照1.3.2的試驗設計進行，超聲功率作為單因素變量，分別選取25，35，45，55和65 W，另外2個定量分別設置為超聲時間30 min、超聲溫度40 ℃，超聲浸提處理后對樣品進行脫溶劑處理待測，計算Q值。由圖1可以看出，3種元素的Q值變化趨勢一致，在25～45 ℃區間呈正比關系，在45～55 ℃區間3種元素Q值略有小幅波動，總體呈平穩趨勢，超過55 W后3種元素Q值均有略微下降趨勢。形成該趨勢主要原因為浸提實質是傳質過程，超聲功率加大，超聲空化作用加強，浸提體系內局部形成的液體噴流動能加大對細胞壁等組織機構沖擊力加大，提高細胞結構通透性，提高傳質效率[15]，另外加大超聲功率可加速體系內質點運動作用，同時提高超聲功率可迅速排除物料中氣體加快溶質進入[21]，但也不可使用過大功率，因為空化作用與超聲頻率密切相關，在超聲振幅一定時超聲功率增大超聲頻率增加，會引起整個體系空化閾值增加，空化作用難以繼續增強甚至會有減弱趨勢[22]，選擇適當功率的低頻率的超聲條件，更有利于超聲浸提。

圖1 超聲功率對Q值的影響

2.1.2 超聲浸提溫度單因素試驗

按照1.3.2的試驗設計進行，超聲溫度作為單因素變量，分別選取20，30，40，50和60 ℃，另外2個定量分別設置為超聲時間30 min、超聲功率45 W，超聲浸提處理后對樣品進行脫溶劑處理待測，計算Q值。由圖2可以看出，3種元素的Q值變化趨勢一致，在20～40 ℃區間呈顯著上升趨勢，在40～50 ℃區間Pb元素Q值呈平穩趨勢，Hg和Fe元素Q值略有增加，超過50 ℃后3種元素Q值均區域平穩，不再繼續增大，甚至略有下降。形成該趨勢主要原因是溫度升高對超聲熱效應有輔助作用，提高體系內質點運動的速度，加之超聲空化作用會產生具有高強動能的沖擊波來改變植物細胞組織的通透性，從而達到提高浸提效率的作用[22]，并且一般常規體系的液體擴散系數與溫度也呈現正相關關系，因為溫度升高，液體體系黏度降低有利于提取[23]，但也不可一味提高溫度，因為超聲聲能最后大部分轉化為熱能[24]，如局部溫度過高會導致易揮發元素損失，而且溫度過高會加快大分子降解，還會發生熱裂解反應產生自由基[25]，而這2種因素都會影響浸提效率和效果。

圖2 超聲溫度對Q值的影響

2.1.3 超聲浸提時間單因素試驗

按照1.3.2的試驗設計進行，超聲時間作為單因素變量，分別選取10，20，30，40和50 min，另外2個定量分別設置為超聲溫度40 ℃、超聲功率45 W，超聲浸提處理后對樣品進行脫溶劑處理待測，計算Q值。由圖3可以看出，在0～20 min內3種元素Q值均隨著超聲時間的增加而增加，20～30 min內3種元素Q值略有增加，與前20 min內趨勢相比增加速度明顯減慢，30 min后曲線趨勢趨于平穩或略有下降趨勢。形成該趨勢主要原因是超聲介入通過空化作用產生的沖擊力，改變細胞組織的通透性，通過微波熱作用和直流作用加速質點運動，溶劑迅速進入物料細胞組織，并且將物料縫隙中的氣體迅速排除，傳質阻力降低[26]，浸提效率大幅提高，隨著超聲浸提時間的延長，整個體系達到一個平衡狀態，此時繼續延長超聲浸提時間，數據趨勢沒有明顯變化。

圖3 超聲時間對Q值的影響

2.2 超聲解吸條件響應面優化試驗

響應面優化試驗設計按照1.3.3中表1的試驗設計方案進行，三水平三因素試驗設計方案及檢測結果見表5。應用Design Expert 8.5.0對數據進行分析和處理，得到的試驗結果回歸擬合模型為R1=2.79+0.50A+0.29B+0.27C+0.25AB-0.18AC-0.047BC-0.84A2-0.50B2-0.28C2。Q（Hg）的響應面回歸模型方差分析結果見表6。

表5 響應面設計方案及試驗結果

表6 Q(Hg)的響應面回歸模型方差分析

表7 響應面尋優結果

由表6得出，在響應面模型二次項中，A、B、C、AB、A2、B2、C2的P值均小于0.01，極顯著，交互影響評定，AB、AC交互作用顯著，其中AB交互極顯著，BC交互作用不顯著。回歸模型P＜0.000 1，模型極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，模型響應值Q（Hg）的二次多項回歸方程決定系數R2=0.987 6、調整系數Radj2=0.971 7，說明模型模擬的精密度、回歸效果及擬合度良好，可信度高，模型可真實反映各因素與響應值之間的聯系。根據回歸模型，做出關于3個超聲浸提因素與響應值的響應面分析圖，結果如圖4所示。

圖4 Q(Hg)響應面圖

按照所得整理值對回歸模型進行驗證性試驗，試驗結果Q（Hg）為2.99 mg/kg，結果證明響應面優化所得預測值與試驗值之間的擬合性良好，模型所得參數切實可行真實有效。

2.3 超聲浸提處理對微波消解條件的影響

按照1.3.5的試驗設計方案進行試驗，其中超聲浸提參數采用2.2中優化出的參數，分別對3種濃度梯度的加標樣品進行檢測。由結果可知，第1組、第2組加標回收率相近，第3組最低，第4組結果最高。由于第1和第2組應用的微波消解溫度較高，所以會造成Hg元素的損失，而且損失量大體相近。第3組沒有應用超聲浸提除去油脂，直接應用低溫消解的方式，造成消化不徹底，影響檢測準確性，特別是在0.05 mg/kg這個濃度加標回收率已經＜60%。第4組為試驗重點研究的方法，加標回收率為4組試驗中最高，對易揮發性元素檢測準確性較高，加標回收率達到測組分含量1～100 mg/kg、回收率范圍90%～110%，測組分含量0.1～1 mg/kg、回收率范圍80%～110%，測組分含量＜0.1 mg/kg、回收率范圍60%～120%的標準。結果詳見表8。

表8 加標回收試驗結果

2.4 多元素檢出限定量限的確定

按照1.3.6的試驗設計，采用2.2中優化出的超聲解吸參數進行試驗，結果各元素檢出限（SMDL）定量限（SLOQ）均低于GB 5009.268—2016中的要求，詳見表9。

表9 方法檢出限、定量限

3 結論

通過超聲輔助浸提法與低溫微波消解法相結合，去除樣品中大量油脂，解決烤肉蘸料多元素檢測過程中，樣品油脂含量過大導致消化不完全及消化溫度高部分元素損失的問題。通過Box-Behnken試驗對方法參數進行優化，得到最優超聲浸提工藝參數：超聲浸提功率50 W、超聲浸提溫度43.6 ℃、超聲浸提時間36 min。應用響應面模型所得參數進行試驗，測得Q（Hg）為2.99 mg/kg。通過4組試驗對不同濃度梯度的Hg進行加標回收試驗，超聲輔助浸提低溫微波消解法加標回收率最高，表明烤肉蘸料等高油脂含量樣品中多元素檢測，可通過乙醚超聲浸提除油處理，降低微波消解溫度梯度，減少易揮發元素的損失。應用試驗方法對26種元素進行檢出限、定量限檢測和計算，結果均符合國標要求。試驗對烤肉蘸料等高含油量的樣品中金屬離子檢測領域的發展具有一定意義。