真菌毒素檢測技術研究現狀與進展
——基于CiteSpace分析

杜要文，姚鋒，李傳鵬，常國立，蔡成崗，陳登

1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室（杭州 310023）；2.浙江省科技信息研究院（杭州 310007）

真菌毒素是真菌在谷物、油料、水果等原料及其加工的食品或飼料等產品里生長所產生的有毒次級代謝產物，對人體和動物的健康都有極大危害，如黃曲霉毒素具有致癌、致突變和致畸形的破壞性，嘔吐毒素在飼料中過高會導致畜禽嘔吐、厭食、腹瀉、發燒等中毒癥狀。已知真菌毒素有400多種，因毒性危害和污染情況經常檢測的幾種毒素有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、赭曲毒素、T-2毒素和伏馬毒素等。真菌毒素除危害人畜健康外，還導致農產品品質下降，對農產品出口產生極大負面影響，對農戶和農業經濟造成巨大損失[1]。因此，如何控制真菌毒素在食品、飼料與農產品中含量的研究顯得尤為重要。GB 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》明確規定食品中黃曲霉毒素B1（AFB1）不得超過20 μg/kg，黃曲霉毒素M1不得超過0.5 μg/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇不得超過1 000 μg/kg，展青霉素不得超過50 μg/kg，赭曲霉毒素A不得超過5.0 μg/kg，玉米赤霉烯酮不得超過60 μg/kg[2]。基于限量標準的檢測技術和方法開發，并針對可能含有真菌毒素的原料和產品進行分析檢測，對保障食物和食品與飼料等產品的安全具有重要意義。

為更好闡述我國在真菌毒素安全檢測方面的工作進展，試驗通過CiteSpace軟件梳理真菌毒素檢測的研究脈絡，通過更加直觀形象的圖示探索該領域的文獻研究變化、研究熱點趨向等內容，為實現發展和建立簡單、快速、綠色、經濟、準確、靈敏和多種毒素檢測技術開發提供思路。

1 數據收集和研究方法

以2000—2023年“中國知網”中“毒素檢測”為主題，篩選出主要主題包含檢測方法、黃曲霉毒素與真菌毒素等的1 388篇文獻，并以此為樣本進行可視化分析，采用CiteSpace可視化分析軟件工具[3-4]，對研究現狀進行總結。

2 特征分析

2.1 主要的檢測方法及進展

真菌毒素自發現后在檢測方法、定量依據、檢測限和定量限等方面進行研究，文獻數量從2000年開始呈現逐年上升的態勢，其中2013年為100篇，發文年限與數量的關系如圖1所示。

圖1 真菌毒素檢測研究發文量趨勢圖

圖1可以反映不同年限的發文數量，檢測方法也逐步呈現變化，毒素最早測試是通過目測法檢測，通過視覺判斷，逐步得到多種方法。

2.1.1 基于生物學原理的方法

包括利用酵母生長和黃質醇氧化等方法，可以檢測到某些真菌毒素。Mitterbauer等[5]開發一種靈敏的酵母生物測定法，無需進一步的凈化步驟即可檢測谷物提取物中玉米赤霉烯酮（ZEN）的雌激素活性；該方法靈敏度高，成本低，具有作為基礎研究的潛力。

2.1.2 物理化學分析方法

包括氣相色譜、高效液相色譜與電化學免疫傳感器等技術，可對真菌毒素進行直接定量和種類鑒定。Lü等[6]研究一種很有前景的無標記電化學發光免疫傳感器，該方法以魯米諾-AgNPs@MC為抗體載體和用于檢測AFB1的傳感平臺AgNPs通過銀-氨基鍵與魯米諾和抗AFB1結合，進一步增強靈敏度。Zhao等[7]使用基于QuEChERS（快速、簡單、廉價、有效、穩定和安全）的植物油提取程序，采用高效液相色譜-串聯質譜對16種化學多樣化的霉菌毒素進行定量和確認。

2.1.3 快速檢測試紙條法

將特定的抗體或親和素固定在檢測試紙上，使其對真菌毒素具有高選擇性和靈敏度，可實現快速檢測真菌毒素的含量和種類。許會靜等[8]用膠體金標記T-2毒素單克隆抗體，通過測定加入不同量碳酸鉀后吸光度的變化，確定標記的最佳pH，通過與抗原進行正交試驗確定最佳組合條件，應用膠體金定量讀數儀通過檢測線和對照線的對比，檢測試紙條的性能，T-2毒素膠體金快速定量檢測試紙條可用于玉米中T-2毒素含量的快速定量檢測。蔡其洪[9]利用單克隆抗體設計的固相免疫分析法以及金標試紙法可對黃曲霉素進行一步式檢測，定性檢測準確度在85%以上，靈敏度4 ng/mL可測出樣品中20 ng/g的黃曲霉毒素。

2.1.4 分子生物學方法

包括基于聚合酶鏈反應（PCR）技術、DNA雜交檢測等，可基于真菌的基因進行檢測，并據此判斷是否存在真菌毒素。PCR診斷已被用作替代檢測方法，取代繁瑣且耗時的微生物和化學方法，用于檢測和鑒定真菌屬鐮刀菌、曲霉菌和青霉菌中最嚴重的毒素產生者[10]。由于PCR技術具有簡單、快速、特異性強和靈敏高等優點，劉繼超等[11]提出了PCR技術在檢測腸毒素的應用，具體包括常規PCR、多重PCR、逆轉錄PCR以及熒光定量PCR，為食品檢測技術的發展提供了有力的技術支持。

2.1.5 光譜學方法

包括質譜、近紅外光譜與拉曼光譜等技術，可通過分子振動和吸收波長差異性對真菌毒素進行檢測。拉曼光譜（SERS）間接檢測技術又被稱為SERS標記檢測技術，其原理是利用特殊的SERS探針示蹤，通過對探針上標記物的檢測和分析，實現對目標分析物的定性或定量分析[12]。陳明明等[13]利用便攜式拉曼光譜儀建立一個快速篩查與檢測谷物中真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）的表面增強SERS方法，制備具有高活性的水凝膠SERS芯片，優化影響水凝膠SERS芯片對DON的SERS響應的實驗條件，實現在小麥粉中DON的檢測，所得回收率為97.3%～103%，相對標準偏差為4.2%～5.0%。

2.2 主要研究領域

通過對文獻分析，制作表1，通過2個時間段的對比發現毒素檢測的研究學科領域包括輕工、畜牧與動物學、預防醫學與衛生學、生物學等領域，近年化學專題研究領域發表論文量增加較多，而排在前3位的輕工與畜牧均涵蓋食品與飼料的生產、制作，由此可知食品毒素檢測領域始終受到社會及研究者的重點關注。

表1 2000—2012年和2013—2023年毒素檢測發表論文量前十名的研究方向對比情況

另外，在食品工業領域，霉菌能在糧食和飼料中腐生或寄生后產生大量有毒代謝產物（毒素），有些毒素的毒力極強，對人畜健康產生極大的危害作用，這些毒素具有抗熱能力，通常加熱不能將其破壞，當人或畜、禽采食霉變的糧食制品或飼料后就會發生多種中毒病[14]，因此毒素檢測至關重要，特別是新方法和新技術的探索與應用。

3 研究趨勢及發展特征分析

研究熱點是真菌毒素檢測領域重要內容，通過關鍵詞聚類分析，認定文獻中出現的頻次及中心性作為研究熱點進行分析。

3.1 基于關鍵詞共現的研究熱點分析

在CiteSpace中，若中心性（centrality）超過0.1的節點，則說明該節點為中心節點，在研究中較為重要且具有較大的影響力。圖2展示關鍵詞共現聚類網絡，其中圓環越大代表相關研究出現的頻次（frequency）越多，圓環由內到外的不同顏色分別表示由遠及近相關研究的不同年份，據統計位列前5位的依次是檢測（frequency=134，centrality=0.34）、真菌毒素（frequency=134，centrality=0.24）、快速檢測（frequency=62，centrality=0.16）、腸毒素（frequency=41，centrality=0.15）、檢測方法（frequency=71，centrality=0.10），說明毒素檢測是推進真菌毒素發展的重要內容，與此同時要兼顧快速檢測技術，進而實現真菌毒素檢測與快速檢測的聯合發展，這也是未來真菌毒素檢測發展研究的重點。另外，針對嘔吐毒素（frequency=36，centrality=0.05），說明對該毒素檢測的研究還不是特別深入，未來有很大的發展空間。

圖2 關鍵詞共現圖譜

通過梳理關鍵詞的聚類圖譜分析發現，真菌毒素、檢測與快速檢測是研究重點（圖3）。作為一種新型識別分子的適配體檢測技術，具有很強的特異性和穩定性，可作為ELISA方法中抗體的一種代替物，也可作為化學和生物傳感器檢測方法中的識別元件[15]。秦美君等[16]以赭曲霉素（OTA）核酸適配體為識別原件，小檗堿為熒光探針發展一種無標記的熒光體系檢測OTA，該方法有較高的特異性，并成功應用于中藥桔梗中OTA的檢測，回收率在86.3%～105.6%。Ramezani等[17]基于核酸外切酶I（Exo I）、核酸適配體互補鏈（CS）、核酸適配體（Apt）-CS偶聯物的拱形結構和金電極的組合，開發用于鏈霉素靈敏和選擇性檢測的電化學適體傳感器，所設計的電化學適體傳感器對鏈霉素表現出高選擇性，檢測限低至11.4 nm，所開發的電化學適體傳感器成功用于檢測牛奶和血清中鏈霉素。在真菌毒素檢測技術被重視的同時，對真菌毒素的毒素基因與原核表達也被部分研究者關注，以期得到相應的抗體，使感染真菌毒素的生物體得到早期診斷治療。

圖3 關鍵詞的聚類圖譜

3.2 基于突現分析方法的前沿分析

關鍵詞共現的Timeline圖是根據考察關鍵詞在時間軸上的分布，從而挖掘該領域內研究前沿主題，而通過突現率可以發現在該段時間內相關文獻的研究重點，并通過關鍵詞可知未來一段時間內該領域的研究方向。

通過梳理2017—2023年文獻發現，快速檢測、真菌毒素及檢測方法基本是同步發展的（圖4）。

圖4 關鍵詞共現的Timeline圖

快速檢測時間線上，免疫檢測技術的發展先后經歷：最初的放射免疫法，即利用具有特異性的抗體或抗原，通過與放射性示蹤物相結合的方式檢測食品中的各類毒素；發展到ELISA技術，以對毒素高度特異性的抗體為識別分子，通過抗體與毒素結合反應的方式進行檢測；再到電化學分析技術、熒光分析技術和生物傳感器等新技術的研究，推動免疫檢測技術的快速發展，并取得重大進展；再到適配體技術、質譜技術和納米顆粒技術等新興技術，不僅提高檢測靈敏度和準確性，而且還拓寬檢測范圍和適用領域。

在農產品和糧食領域，由于真菌生長有一定的地域性，不同區域占優勢的真菌毒素種類也不同，如在亞熱帶和熱帶地區，農產品和飼料主要被黃曲霉素和某些赭曲毒素污染；而玉米赤霉烯酮、嘔吐霉素、赭曲霉毒素A、T-2毒素、煙曲霉毒素則在溫帶地區占有顯著優勢[18]。從全球范圍來看，食品安全問題經常是由谷物、堅果、水果和綠色咖啡豆上的真菌毒素所造成，其中，以花生和玉米的污染最為嚴重。因而真菌毒素的無損檢測技術得到較快發展，包括光譜學技術（如近紅外光譜、中紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜）、太赫茲時域光譜成像技術（如高光譜及多光譜成像、彩色成像、熱成像、X射線成像）及電子鼻技術等[19]。無損檢測技術通常應用于玉米及小麥中真菌及毒素的檢測，未來無損檢測技術還需進行深入研究，如在短時間內對不同農產品中的多種真菌或毒素進行同時分析，利用更大的數據集和先進的化學計量學軟件開發更穩健的校準模型，以及提高檢測結果的靈敏度、準確性和重復性等，隨著設備及儀器價格的降低和新算法的發展，這些無損快速的檢測技術將對農業真菌和真菌毒素污染檢測有更大價值[20]。隨著這些技術的發展，使檢測食品及農作物中相關毒素更加簡便且準確度更加可靠，便利了對真菌毒素的風險評估，有利于如今糧食的貯存，增大了儲糧安全系數，使食品安全得到相對更好的保障性。

通過對已有文獻中關鍵詞突現圖譜（圖5）分析發現，2017—2018年霉菌毒素污染飼料原料成為研究熱點。據我國飼料霉變情況調查報告，真菌的檢出率和含量，南方地區大幅高于北方地區，特別是5—9月份，南方地區的平均氣溫都處于20 ℃以上，平均相對濕度在80%以上，這種高溫高濕的環境條件下，真菌生長繁殖最為旺盛，谷物飼料霉變率高；北方的夏季高溫低濕，不易霉變，常因加工、運輸或貯存不當而產生真菌毒素[21]；因此發展靈敏度高、響應迅速、專業性強的膠金體免疫層析技術[22]檢測毒素，用于食品、飲料、農產品和環境中毒素的檢測。

圖5 關鍵詞突現圖譜（提取前12個）

2019—2021年這一時間段的研究熱點主要集中在針對中藥材與食物中的真菌毒素，旨在保證中草藥的質量和有效性，《中華人民共和國藥典》[23]中有詳細的中藥材真菌毒素檢測的官方規范方法，主要適用于玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、展青霉素，以及多種真菌毒素，常采用高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜-質譜聯用技術[24-26]及酶聯免疫吸附技術（ELISA）[27]和免疫層析技術[28]分析。

近2年熒光技術與納米材料檢測毒素成為研究熱點。一方面，熒光光譜法（FS）是一種利用物質熒光性質進行快速無損檢測的方法[29]。該方法已廣泛應用于農產品中真菌毒素的檢測[30]，并且激光誘導熒光（LIFS）、單光子誘導熒光在真菌毒素檢測中應用較廣泛[31]。黃曲霉毒素AFB和AFG在受到紫外線照射時會產生青黃色熒光，這使得FS分析黃曲霉毒素的侵染成為可能[32]。另一方面，納米材料因其具有高比表面積、獨特的物理化學性質和生物兼容性，被廣泛應用于毒素檢測中，在對毒素進行檢測時，納米材料可作為檢測試劑或者載體，常用的納米材料可以分為金屬納米粒子、量子點、碳納米管等。以金屬納米粒子為例，如利用納米金顆粒表面的抗體與毒素結合的特異性，可以制備出高靈敏度的適配體傳感器可用于不同毒素的同時檢測[33]。另外，也可將納米材料與萃取、PCR等技術相結合，提高毒素檢測的靈敏度和準確性。納米材料還被應用于直接篩查食品、水源、空氣等環境中的毒素，例如利用碳納米管構建納米電極來實現農業食品中霉菌毒素的檢測。不足之處是在使用熒光光譜法進行毒素檢測時，需要選擇合適的熒光染料以及適宜的激發波段、檢測波段和檢測時間等條件，以獲得最準確的檢測結果。同時前處理方法和納米材料的安全性等問題也需提升。

4 結論與展望

通過CiteSpace對“中國知網”上以毒素檢測為主題分析其研究進展，結果表明輕工業手工業領域研究最多，其他如畜牧與動物學、預防醫學與衛生學也是該領域主要的研究方向，分析用于糧食、飼料、中藥材等的真菌毒素快速檢測技術及最新方法，如適配體檢測技術、免疫檢測技術、熒光技術與納米材料基礎上的檢測方法等。隨著科技水平的進步，真菌毒素分析研究會呈現以下的主要趨勢。

4.1 真菌毒素檢測速度更快

近年來新興技術已在真菌毒素檢測速度方面取得重大突破。如高通量平臺和人工智能算法的使用，可在更短時間內同時檢測多種真菌毒素，檢測結果可在幾分鐘到幾小時內得出。此外，分子生物學技術的不斷發展也推動快速檢測方法的出現。如PCR、LAMP等分子診斷技術，可在不需要培養真菌的情況下，通過檢測其基因特征來快速識別和定位不同毒素形式，大幅縮短與傳統檢測方法相比的時間。這些創新無疑將加速真菌毒素檢測過程，并提高其精確性和可靠性。

4.2 真菌毒素檢測的精確性和靈敏度提高

現代分子生物學、免疫學和納米技術等新技術的運用，使得真菌毒素檢測精準度和靈敏度得到很大提高。如聚集誘導發光劑（AIEgens）可提高檢測靈敏度和通量，抑制傳統熒光納米材料在聚集時易引起的猝滅效應。此外，納米技術也可用于制備高效、高靈敏度檢測指示劑和自動化檢測芯片等檢測器件。這些將促使真菌毒素檢測提高其精確性和可靠性。

4.3 真菌毒素檢測方法更加簡便

高通量平臺或人工智能算法可同時檢測多種真菌毒素，而且操作簡單，不需要經過專業人員長時間的培訓。一些商業化的檢測試劑盒也使得真菌毒素檢測變得更為簡便和快捷。此外紙基檢測技術已被開發用于檢測食品和飲料中的真菌毒素，該技術使用的芯片可大幅縮短檢測時間，并且成本較低，可進行定量分析，有望廣泛應用于實際測試。

4.4 真菌毒素檢測范圍更加廣泛

隨著科技進步和食品安全意識的提高，真菌毒素檢測范圍將更加廣泛。除了糧食、蔬菜、肉類等普通食品領域，真菌毒素檢測也將逐漸擴展至飲用水、保健品、藥物、寵物食品等方面，甚至建材和環境領域。隨著科技不斷發展，真菌毒素檢測技術將變得更加靈敏和準確，從而帶來更好的檢測效果，有利于保障食品安全和公眾健康。