水產(chǎn)品中獸藥殘留的液相色譜前處理方法的研究進(jìn)展

李燕瑩，易云婷，戚平，劉冬豪，陳佩儀，毛新武

廣州市食品檢驗所（廣州 510000）

水產(chǎn)品中獸藥殘留主要包括磺胺類、喹諾酮類、硝基呋喃類、糖皮質(zhì)激素類、氯霉素、三苯甲烷染料、抗生素、殺蟲劑、性激素類、鎮(zhèn)靜劑等化合物。水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢驗方法主要包括氣相色譜法[1-2]、液相色譜法[3-4]。常用的檢驗方法為液相色譜法，其前處理方法有固相萃取、QuEChERS、固相微萃取、液-液萃取[5-6]四大類，超聲輔助萃取[7]和微波輔助萃取[8]也有研究用于前處理。

食品安全監(jiān)督抽檢實施細(xì)則中不同水產(chǎn)品類別指定的獸藥殘留檢驗方法不同，不同的方法需要不同的試劑耗材設(shè)備，檢驗耗時長且不環(huán)保，因此尋找一種通用的檢驗方法顯得尤為重要。文章基于2021—2023年的食品安全監(jiān)督抽檢實施細(xì)則中水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢驗方法分析現(xiàn)狀，綜述固相萃取、QuEChERS、固相微萃取這3種水產(chǎn)品中獸藥殘留的液相色譜前處理方法的研究進(jìn)展。以期為尋找經(jīng)濟(jì)高效、穩(wěn)定準(zhǔn)確的檢驗方法提供思路，展望頒布適用范圍較廣的水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢驗方法，經(jīng)濟(jì)高效，減少污染。

1 2021—2023年食品安全監(jiān)督抽檢實施細(xì)則中水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢驗方法

參考2021—2023年食品安全監(jiān)督抽檢實施細(xì)則中水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢驗方法，分析其指定檢驗方法的變化和適用范圍（表1），并分析不同檢驗方法的適用范圍、液相色譜前處理方法、測試儀器和靈敏度（表2）。

表1 2021—2023年食品安全監(jiān)督抽檢實施細(xì)則中水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢驗方法

表2 水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢驗方法的適用范圍、液相色譜前處理方法、測試儀器和靈敏度

現(xiàn)行細(xì)則中氯霉素檢驗方法GB 31658.2—2021《動物性食品中氯霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的水產(chǎn)品適用范圍縮小了。對比GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》，兩者的前處理方法原理基本一致，但是使用的試劑種類、順序和量不同。相比之下，GB 31658.2—2021提取步驟避免使用分液漏斗，更加節(jié)省試劑，減少操作時間。對比GB/T 20756—2006《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，GB 31658.2—2021使用乙腈輔助提取，避免只用乙酸乙酯萃取過多脂類，并在凈化步驟使用C18SPE，去脂效果更好。

硝基呋喃類檢驗方法GB 31656.13—2021《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的適用范圍也是縮小了。另外，貝類的指定方法在3年間兩度變更。對比農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和農(nóng)業(yè)部781號公告-4-2006《動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，兩者的前處理方法原理基本一致，后者需要先洗滌再衍生和提取，減少干擾，前者無需洗滌，經(jīng)濟(jì)高效。對比農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006和GB 31656.13—2021，兩者的前處理方法原理和步驟基本一致，只有用乙酸乙酯4 mL提取2次和8 mL提取1次，以及濾膜規(guī)格的區(qū)別，但是檢驗方法適用范圍不同。

磺胺類和喹諾酮類檢驗方法均為農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，同一檢驗方法可以測定2種化合物，減少環(huán)境污染，經(jīng)濟(jì)高效。另外，這個方法適用范圍涵蓋甲氧芐啶，但是甲氧芐啶檢驗指定另一方法。

GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》中液相色譜-質(zhì)譜法的靈敏度更佳，與GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法》檢出限一致，但熒光檢測法抗干擾能力明顯不如液相色譜-質(zhì)譜法。所以，從2022年開始孔雀石綠指定使用GB/T 19857—2005檢驗。

在我國植物源性食品的農(nóng)藥殘留測試中，已頒布適用范圍較廣的GB 23200.113—2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》及GB 23200.121—2021《植物源性食品中331種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》。這2個方法涵蓋大多數(shù)的基質(zhì)，并對基質(zhì)進(jìn)行分類，不同類別基質(zhì)使用不同的前處理方法，提高檢驗效率。在水產(chǎn)品中獸藥殘留檢驗中，SN/T 3235—2012《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》也將基質(zhì)分為牛奶、動物肌肉、肝臟、水產(chǎn)品4大類，并且前處理使用QuEChERs，有發(fā)展應(yīng)用的潛力。

繁復(fù)的前處理方法增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，多消耗的試劑耗材污染環(huán)境。所以尋找一套高效通用的前處理方法非常必要。對近幾年水產(chǎn)品中獸藥殘留液相色譜的前沿前處理方法進(jìn)行綜述，為開發(fā)新方法提供思路，展望水產(chǎn)品中獸藥殘留檢驗也能夠有適用范圍較廣的前處理方法頒布，減少消耗，經(jīng)濟(jì)高效。

2 水產(chǎn)品中獸藥殘留的液相色譜前處理方法的研究進(jìn)展

2.1 固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）用于水產(chǎn)品中獸藥殘留的液相色譜前處理

SPE自1951年被報道以來[9]，已成為常用的前處理方法，通過吸附材料的選擇可以富集不同的化合物，現(xiàn)在大部分SPE吸附材料可富集微克級待測物，并有很好的回收率[10]。錢振杰等[11]通過將SPE用于水產(chǎn)品中獸藥殘留的液相色譜前處理的研究，測定6種丁香酚類化合物殘留量，定量限低至0.02 mg/kg，方法簡單靈敏。

常規(guī)SPE需要活化凈化小柱、洗脫、富集，耗時較長。快速濾過型凈化（multi-plug filtration cleanup，m-PFC）柱填料主要是C18、PSA、多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT），不用活化凈化小柱。王強等[12]使用m-PFC測試牛蛙中50種獸藥殘留，檢出限為0.5～1.0 μg/kg，回收率為79.4%～112.1%。并且分析EMR-Lipid、m-PFC、PRiME HLB這3種SPE柱的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m-PFC效果最好。m-PFC柱含有MWCNT，可以凈化部分色素，使回收率更好。近年來，在線SPE取得重大進(jìn)展，實現(xiàn)在線凈化基質(zhì)，減輕人力作業(yè)并提高效率。歐陽少倫等[13]使用在線SPE凈化水產(chǎn)品，進(jìn)行123種獸藥殘留的測試，檢測低限可達(dá)0.1～50 μg/kg。另外，許多SPE的分支體系有新的研究進(jìn)展。

2.1.1 分散固相萃取（dispersed Solid Phase Extraction，dSPE）

dSPE是直接將吸附材料加入樣品基質(zhì)溶液中，吸附基質(zhì)干擾或選擇性吸附待測物。從傳質(zhì)角度看，dSPE可以增加基質(zhì)和吸附材料的接觸面積，操作過程比常規(guī)SPE快，提取效率高[14]。

MWCNT為大共軛結(jié)構(gòu)，可以提供分子間形成氫鍵和π鍵，對帶共軛結(jié)構(gòu)的分子，即胺類、醇類、酚類都有很好的富集凈化效果，是一種潛力很大的dSPE吸附材料，近年來備受關(guān)注[15]。石墨化MWCNT是MWCNT衍生產(chǎn)物，其表現(xiàn)出超MWCNT的卓越性能，被用于水產(chǎn)品中獸藥殘留的前處理[16]。Huang等[1]使用石墨化MWCNT輔助的dSPE方法分析50種魚類樣本中的麻醉劑和鎮(zhèn)靜劑殘留，檢出限為0.03～0.4 μg/kg，回收率為86.3%～111.7%。Phomai等[17]使用鞣酸、含有Fe3+的溶液、緩沖液和樣品直接“一鍋法”反應(yīng)，原位生成鞣酸與Fe3O4的螯合配體化合物作為吸附材料，檢驗動物樣本中的四環(huán)素藥物，檢出限為1.06～3.19 ng/mL，回收率為79.3%～107.1%。該方法不需要準(zhǔn)備固體吸附材料，思路新穎。

2.1.2 磁固相萃取（magnetic solid phase extraction，MSPE）

dSPE需要經(jīng)過離心和過濾回收吸附材料，而MSPE只需磁鐵吸附即可收集吸附材料，非常高效[18-19]。MSPE的核心在于制備磁性納米微球。許多金屬可作為磁性納米微球骨架，如鐵、鈷、鎳、Fe3O4、γ-Fe2O3。其中，F(xiàn)e3O4應(yīng)用最為廣泛，其具有易于制備、易于表面改性、磁性強等優(yōu)點。對磁性納米微球骨架進(jìn)行表面改性，就能得到不同性能的吸附材料，如：用C18修飾磁性納米微球，利用C18官能團(tuán)疏水性，對疏水性物質(zhì)的分離富集有良好表現(xiàn)；用高分子修飾可以讓磁性納米微球生物相容性變好，改善容易氧化和穩(wěn)定性差等缺陷；選擇不同高分子的官能團(tuán)，對于不同化合物有選擇性富集的效果。

Li等[4]通過限進(jìn)介質(zhì)固相萃取吸附材料——牛血清白蛋白限制-十八烷基/苯基混合功能化磁性二氧化硅納米顆粒（BSA-C18/Ph-Fe3O4@SiO2NP）富集12種水產(chǎn)品中的舍曲林和苯海拉明，液相色譜-質(zhì)譜法檢出限低至0.018 μg/kg，回收率為91.6%～103.6%。牛血清白蛋白可以阻止大分子（主要是蛋白質(zhì)）吸附，允許小分子通過并被內(nèi)部材料吸附。其機(jī)理是限進(jìn)介質(zhì)的蛋白質(zhì)排斥機(jī)制（通過基于親水基團(tuán)組成的網(wǎng)格，或通過尺寸排阻構(gòu)建的物理屏障）。Liu等[20]通過二乙烯基苯、N-乙烯基吡咯烷酮和Fe3O4制備磁性納米微球Fe3O4@SiO2@DVB-NVP（Poly-MDN），接著使用優(yōu)化配比的Poly-MDN、C18、石墨化碳黑（GCB）作為凈化劑進(jìn)行基質(zhì)凈化，對24種水產(chǎn)品進(jìn)行112種獸藥殘留的測試，檢出限為0.1～2.0 μg/kg。這一方法材料制備簡單，測試范圍廣泛，有很大的應(yīng)用前景。Shen等[21]通過制備磁性共價有機(jī)框架/氧化石墨烯復(fù)合材料測試鯉魚、黃花魚和蝦中的奧司他韋，檢出限為0.035 μg/kg，回收率為87%～116%。該方法結(jié)合氧化石墨烯、共價有機(jī)框架材料及MSPE，氧化石墨烯在有機(jī)物提取富集中有著巨大優(yōu)勢[22]，而共價有機(jī)框架材料有巨大的比較面積和易于改性[23]，二者與MSPE結(jié)合勢必會有很多新應(yīng)用。

2.1.3 分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）萃取

常規(guī)SPE主要依靠C18等材料基于非特異性疏水作用進(jìn)行萃取，會導(dǎo)致很多干擾化合物的共萃。分子印跡技術(shù)通過合成方法制備具有特定分子識別的功能化材料，可作為某一類化合物的專用吸附材料[24]。Wang等[25]使用α-氯DDT（三氯殺螨醇的結(jié)構(gòu)類似物之一）作為虛擬模板，通過水懸浮液合成MIP微球，使用甲基丙烯酸、乙二醇二甲基雙丙烯酸酯和聚乙烯吡咯烷酮作為單體的聚合、交聯(lián)劑和分散劑制備了對于三氯殺螨醇具有高選擇性的MIP微球，測試6種水產(chǎn)品中的三氯殺螨醇?xì)埩袅浚瑱z出限為0.1 ng/g，回收率為85.8%～101.2%。

2.2 QuEChERS用于水產(chǎn)品中獸藥殘留的液相色譜前處理

QuEChERS結(jié)合樣品預(yù)處理和dSPE兩個過程，是由dSPE商品化規(guī)模化而來，自2003年報道以來[26]，被廣泛應(yīng)用于樣品前處理。通過對萃取溶液或萃取粉包的選擇，可將不穩(wěn)定分析物的降解影響降低，同時保證較好的萃取凈化效果及回收率[15]。QuEChERS與傳統(tǒng)的提取技術(shù)相比，有樣品和溶劑消耗更少、樣品制備時間更短的優(yōu)點。

Gan等[2]使用常規(guī)QuEChERS進(jìn)行水產(chǎn)品中的6種二酰肼測試，并且研究凈化步驟中GCB和C18對于水產(chǎn)品的影響。研究發(fā)現(xiàn)PSA/C18結(jié)合用于凈化水產(chǎn)品效果較好，回收率可達(dá)90.5%～95.8%，而PSA/GCB結(jié)合對水體沉積物的凈化效果更好。Kim等[27]研究水產(chǎn)品測試中的提取溶液及水的影響。通過32種農(nóng)藥和20種藥品的測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：10 mL蒸餾水和10 mL添加1%富馬酸的乙腈提取效果最好；萃取層下方的水層可以富集大量的水溶性基質(zhì)，減少萃取層的共萃物，減少基質(zhì)效應(yīng)。另外，水的加入可讓萃取層清澈，便于液相色譜-質(zhì)譜分析。

QuEChERS在萃取溶劑、凈化粉包選擇上都有很多注意事項。萃取溶劑一般選擇乙腈，因為加入NaCl可以很好地鹽析分層，共萃物較少。另外，乙酸乙酯和丙酮也是不錯的溶劑。單試劑使用乙酸乙酯會有較多脂肪類分子共萃，如果待測物質(zhì)是非極性化合物為主，可以考慮使用乙酸乙酯萃取。丙酮則是水相溶性更佳，能萃取很多極性分子，特定應(yīng)用也可以考慮。凈化粉包方面，PSA主要去除有機(jī)酸、糖類、脂類，C18主要去除脂類和固醇，GCB主要去除色素（但是也會吸附平面結(jié)構(gòu)的物質(zhì)）。如果測試聯(lián)苯類平面結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在凈化步驟可以加入一些甲苯。在低pH基質(zhì)中，加入醋酸緩沖鹽對于堿性化合物的回收率會更好。而對于脂肪含量較高的基質(zhì)，凈化步驟加入EMR lipid這類新型的脂肪吸附材料再反萃，回收率會更好。

2.3 固相微萃取（Solid Phase microextraction，SPME）用于水產(chǎn)品中獸藥殘留的液相色譜前處理

SPME將3個關(guān)鍵前處理步驟（取樣、提取和預(yù)濃縮）合并為一個步驟，操作非常方便[28]，是很好的分析生物基質(zhì)方法。SPME還可以實現(xiàn)活體取樣，這是其他前處理方法無法比擬的。

Tang等[29]使用定制的生物相容性C18-PAN纖維頭（45 μm）萃取河豚體內(nèi)的氟喹諾酮藥物，取樣點為活體河豚背側(cè)近軸肌肉，纖維內(nèi)SRSD為11.2%～14.3%（n=6），纖維間SRSD為13.1%～16.1%（n=5），檢出限可低至0.3 ng/g。Mondal等[30]使用金屬-有機(jī)框架材料MIL-101(Cr)-NH2修飾SPME纖維頭，在活體羅非魚體內(nèi)測試6種抗生素。使用水熱法，通過硝酸鉻水合物、2-氨基對苯二甲酸制備MIL-101(Cr)-NH2顆粒，將金屬-有機(jī)框架材料涂布于石英纖維頭上，纖維頭用于提取魚背中軸的肌肉中抗生素，檢出限可低至0.18～1.12 ng/g，并且方法重現(xiàn)性好，纖維內(nèi)SRSD為1.5%～8.3%，纖維間SRSD為7.3%～14.5%。使用容易形成分子間氫鍵的纖維，大部分抗生素都有比較多容易形成分子間氫鍵的位點。該方法有望拓展應(yīng)用于更多的獸藥殘留測試中。

3 結(jié)語和展望

分析現(xiàn)行細(xì)則中水產(chǎn)品獸藥殘留檢驗方法，有的檢驗方法是8年前的標(biāo)準(zhǔn)，雖說方法經(jīng)典好用，但是隨著技術(shù)進(jìn)步，應(yīng)加快推進(jìn)食品安全標(biāo)準(zhǔn)的更新迭代，將更加高效準(zhǔn)確的方法納入細(xì)則中。另外，許多檢驗方法原理和步驟基本一致，只是涵蓋的化合物或基質(zhì)不同。可能是沒有擴(kuò)大做更多化合物或更多基質(zhì)的方法驗證的原因。希望未來通過擴(kuò)大食品安全標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍，同一檢驗方法可以測試更多基質(zhì)和化合物，提高經(jīng)濟(jì)效率和減少環(huán)境污染。

成熟的大規(guī)模檢驗方法需要操作簡單、測試速度快、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果準(zhǔn)確這幾個關(guān)鍵因素。綜合上述研究進(jìn)展，參考農(nóng)藥殘留已經(jīng)在大力推廣QuEChERS方法，把待測物基質(zhì)分類，對應(yīng)使用不同方法包，QuEChERS更有潛力成為通用的水產(chǎn)品中獸藥殘留前處理方法。但是QuEChERS也有其局限性，所以對于某種特定基質(zhì)或者化合物需要單獨的前處理方法作為補充。盡管如此，也能大大減少實驗室的設(shè)備及耗材，做到經(jīng)濟(jì)高效環(huán)保。