HPLC對檳榔鹵水原料飴糖中葡萄糖和麥芽糖的測定

陳升，劉朝來 ，龔卓，羅秋鵬，尹興筍，周春

1.湖南伍子醉實業集團有限公司（湘潭 411228）；2.常德市自來水有限責任公司（常德 415001）

飴糖，性溫、味甘，為藥食同源之品，應用較廣泛，具有非常重要的研究價值[1]。在我國早期飴糖的生產主要是人們利用發了芽的小麥、大麥或其他谷物，經發酵、蒸煮、熬制而成[2]，現在工藝主要是用酶法生產飴糖[3]。飴糖有補中緩急的功效，可以緩解腹中冷痛、食少嘔吐的癥狀。飴糖和石灰粉是食用檳榔鹵水[4]體系中最重要的組成部分，能直接賦予食用檳榔鹵水最基礎的組織結構及特殊口感[5]。其在食用檳榔鹵水中的主要起到調味和中和石灰降低其堿性，減少燒口現象使其適口性變好，能保護咀嚼者口腔黏膜，其中與石灰發生反應的主要為還原糖，而飴糖中的還原糖基本是葡萄糖和麥芽糖，因此控制好葡萄糖和麥芽糖的比例能對檳榔鹵水改良技術提供支持[6]。

國內檢測葡萄糖和麥芽糖的方法有多種，主要分三大類，分別是光譜法、色譜法和滴定法。其中，光譜法和滴定法都是將還原糖轉化為葡萄糖作為最終產物來測定含量的，過去常采用的色譜法是氣相色譜法和薄層色譜法，氣相色譜法中由于糖本身沒有足夠的揮發性，需將其轉化為揮發性衍生物進行分析，制備過程操作繁瑣，耗時長，易產生多種衍生物的異構體[7]。薄層色譜法的優點是操作快捷有效、無需衍生化處理，但多種單糖的分離效果差，微量成分顯色不明顯而且重現性不好，適合簡單樣品的定性分析而不能滿足復雜的樣品的定性定量。而液相色譜法則可直接對葡萄糖和麥芽糖進行定性定量分析[8-9]。其中，GB 5009.8—2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》[10]和GB/T 20883—2017《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[11]都對糖類含量分析提供液相色譜分析的方法。

試驗采用液相色譜儀法對同時測定飴糖樣品中葡萄糖和麥芽糖進行研究，改進色譜分離條件，以提高檢測靈敏度并延長色譜柱的使用壽命。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（配示差折光檢測器，美國Agilent公司）；ME-204分析天平、MS105DU半微量天平（梅特勒儀器有限公司）；超純水機（湖南中沃水務環?？梢杂邢薰荆?；16D033超聲波清洗機（寧波新芝科技有限公司）。

葡萄糖標準物質（純度≥99.9%，北京壇墨質檢有限公司）；麥芽糖標準物質（純度≥94.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈（色譜純，TEDIA）；氨水（色譜純，上海安譜科技有限公司）；超純水為實驗室自制。

1.2 色譜條件

色譜柱Waters XBridge-Amide（3.5 μm×4.6 mm×150 mm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%氨水（體積比），流動相A與B按75∶25（V/V）預混合（約pH 9.5）后經0.45 μm有機系濾膜過濾。流速0.5 mL/min；柱溫60 ℃；檢測器溫度40 ℃；進樣量5 μL；檢測器RID（示差折光檢測器）。

1.3 標準儲備液的配制

用半微量天平精確稱取0.200 20 g葡萄糖標準物質，溶解后定容至100 mL容量瓶中，配制成2.00 mg/L的葡萄糖標準儲備液，儲存于4 ℃冰箱中；用半微量天平精確稱取0.211 64 g麥芽糖標準物質，溶解后定容至50 mL容量瓶中，配制成4.00 mg/L的麥芽糖標準儲備液，儲存于4 ℃冰箱中。

將葡萄糖標準儲備液用超純水逐級稀釋成質量濃度為2.00，1.50，1.00，0.50和0.25 mg/mL的標準使用液；將麥芽糖標準儲備液用超純水逐級稀釋成質量濃度為4.00，3.00，2.00，1.00和0.50 mg/mL的標準使用液。

1.4 樣品的處理方法

準確稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）飴糖，溶解后定容至100 mL容量瓶中，混勻，取2 mL經0.45 μm水系濾膜過濾后上機檢測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

試驗初期分離柱選擇的是Hypersil NH2糖分析柱[12]，以乙腈-水75∶25（V/V）作為流動相。雖然也能得到較好的分離度和線性關系，但由于飴糖呈弱酸性，酸性物質的存在意味著質子的存在，會使略帶負電荷的氨基官能團質子化，因此導致致使用一段時間后柱效下降較快，使用壽命短。

在選擇Waters XBridge-Amide（3.5 μm×4.6 mm×150 mm）分離柱后此現象有所改觀，但沒過段時間仍需對分離柱進行清洗或再生，對流動相的pH進行調節，將流動相改為乙腈-0.1%氨水75∶25（V/V）后此現象大為改觀。分離柱的使用壽命也大幅延長。

2.2 線性范圍

按2.1中色譜條件設置高效液相色譜儀參數，注入葡萄糖和麥芽糖標準使用液，分別測定其峰面積，以標準使用液質量濃度X（mg/L）為橫坐標、相應峰面積Y為縱坐標進行線性擬合，得：葡萄糖線性回歸方程Y=88 327.9X+484.8，r=0.999 8；麥芽糖線性回歸方程Y=87 719.3X-362.2，r=0.999 8。結果表明，葡萄糖在0.25～2.00 mg/mL、麥芽糖在0.5～4.00 mg/mL的范圍內線性關系良好。飴糖葡萄糖、麥芽糖色譜分析圖見圖1，葡萄糖校正曲線圖見圖2，麥芽糖校正曲線圖見圖3。

圖1 飴糖葡萄糖、麥芽糖色譜分析圖

圖2 葡萄糖校正曲線圖

圖3 麥芽糖校正曲線圖

2.3 精密度與檢出限

按2.1中色譜條件設置高效液相色譜儀參數，將質量濃度0.25 mg/L和2.00 mg/L的葡萄糖標準使用液和1個飴糖樣品連續進樣6針，測得葡萄糖低、中、高三水平的SRSD，見表1。

表1 葡萄糖三水平的SRSD結果

將質量濃度0.50 mg/L和4.00 mg/L的麥芽糖標準使用液和1個飴糖樣品連續進樣6針測得麥芽糖低、中、高三水平的RSD見表2。

表2 麥芽糖三水平的SRSD結果

由表1、表2可知，葡萄糖和麥芽糖的相對標準偏差分別為葡萄糖0.55%和0.40%，結果符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[11]附錄F中實驗室內變異系數≤2.0%，表明方法精密度良好。參考《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[13]，考慮到分析物中的目標物含量遠超過檢出限（LOQ），因此并未對該方法的檢出限和定量限做過多的考慮，僅以低水平的3倍SD計算該方法檢出限，得該方法葡萄糖的檢出限為0.04 mg/mL；麥芽糖檢出限為0.015 mg/mL，已能滿足日常檢測需求。

2.4 回收率

參考GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》附錄F中的方法對飴糖進行加標回收率的測定，準確稱取15份同一個飴糖樣品，每份0.500 0 g，分別對其1～15號進行編號，1～3號樣品用超純水溶解并定容至100 mL，根據葡萄糖和麥芽糖的檢出限對第1組4～6號樣品加標為：樣品用超純水溶解后分別加入2 mL的2.00 mg/mL葡萄糖標準溶液和1 mL的4.00 mg/mL麥芽糖標準溶液并用超純水定容至100 mL。第2組7～9號樣品的加標為：樣品用超純水溶解后分別加入25 mL的2.00 mg/mL的葡萄糖標準溶液和25 mL的4.00 mg/mL的麥芽糖標準溶液并用超純水定容至100 mL。第3組10～12號樣品的加標為：樣品用超純水溶解后加入50 mL的2.00 mg/mL的葡萄糖標準溶液并用超純水定容至100 mL。第4組13～15號樣品的加標為：樣品用超純水溶解后加入50 mL的4.00 mg/mL的麥芽糖標準溶液并用超純水定容至100 mL的方法進行回收率測定試驗，計算回收率及SRSD值，具體結果見表3～表5。

表3 飴糖樣品的葡萄糖和麥芽糖含量結果（n=3）

由表3可知，作為底物的飴糖中葡萄糖含量和麥芽糖含量分別為17.2%和39.2%。由表4可知，在方法檢出限水平、常規樣品水平和方法曲線最高限度這三水平葡萄糖的加標回收率分別為99.4%，100.0%和100.2%，SRSD為0.40%。由表5可知，在方法檢出限水平、常規樣品水平和方法曲線最高限度這三水平麥芽糖的加標回收率分別為97.8%，98.3%和99.5%，SRSD為0.90%。所有加標結果回收率均在95%～105%之間，符合GB/T 27404—2008所要求的加標回收率的范圍，因此說明該方法的準確度和重現性均為優秀。

表4 葡萄糖三水平回收率試驗結果（n=3）

表5 麥芽糖三水平回收率試驗結果（n=3）

2.5 樣品分析

在鹵水房隨機抽取6桶飴糖，每桶取6個樣品，將其按1.4的樣品處理方法處理后注入高效液相色譜儀進行測定，結果見表6。

表6 樣品含量測定結果（n=6）單位：%

3 結論

建立高效液相色譜法同時測定檳榔鹵水一種重要原料——飴糖中葡萄糖和麥芽糖含量的方法，該法簡便快捷，靈敏度高，重現性好，檢出限低適用于食用檳榔鹵水的原料——飴糖中的葡萄糖和麥芽糖含量的測定，既可為廣大檳榔生產企業提供原料進廠檢驗的依據，也可作為控制鹵水反應程度的指標，該方法對食用檳榔鹵水的改良提供技術支持。